Vero細胞乙型腦炎滅活疫苗制備過程中制造工藝及檢定技術的優(yōu)化.pdf

1、目的：為了提高產品的質量，制造出更經濟、更安全、更有效乙型腦炎滅活疫苗，我們從生產和檢定兩個方面著手：一是簡化生產程序，優(yōu)化制備疫苗過程中的各個環(huán)節(jié)，選擇最簡單、最便宜又高效的方式方法進行生產，使乙腦疫苗更加安全、有效，且價格更便宜；二是完善檢定技術，尋找最合適檢測方法，減少干擾因素，使檢測方法簡單，條件易于控制。制定嚴格的操作規(guī)程，使檢定結果最接近真實值，更能體現(xiàn)疫苗的真實情況，制造出更安全的人用乙型腦炎疫苗。
　　 方法：<

2、br>　　 1．復蘇Vero細胞，并在細胞瓶中傳代、擴增，建立主細胞庫和工作細胞庫。
　　 2．將乙腦病毒鼠腦P3株感染Vero細胞，制備乙型腦炎病毒Vero細胞P3株（P3MV株），建立主種子批和工作種子批。
　　 3．用乙型腦炎病毒P3MV株接種Vero細胞，在適宜溫度下培養(yǎng)，當細胞病變達到+++～++++時，收獲病毒液。
　　 4．將收獲的病毒液合并、滅活、濃縮、純化，經稀釋制備成乙腦疫苗成品，再分裝、凍

3、干。
　　 5．按照《中國藥典三部》2005版的要求，對制備疫苗的各個環(huán)節(jié)及半成品、成品進行檢定。
　　 結果：
　　 1．擴增細胞，經過傳代擴增，將Vero細胞131代定為主細胞庫，135代為工作細胞庫；
　　 2．制備毒種庫，乙型腦炎病毒Vero細胞P3株，經檢測毒力穩(wěn)定，免疫原性好，對現(xiàn)在流行的病毒株都具有良好的保護作用，建立病毒庫，將5代設為主種子批，8代設為工作種子枇；
　　 3．收獲病

4、毒液，在接種病毒后每日觀察細胞病變，當細胞病變達到+++～++++時收獲病毒液，每日收獲1次，連續(xù)收獲3～5天，合并后加入甲醛滅活。
　　 4．將滅活實驗合格的病毒收獲液超濾濃縮50倍。
　　 5．采用凝膠層析的方法純化疫苗，去除雜蛋白，降低不良反應的發(fā)生。
　　 6．將純化后原液稀釋分裝，制各成凍干或者水針。
　　 7．按照藥典的要求對成品進行全面檢定。
　　 結論：
　　 1．使用Ve

5、ro細胞作為乙腦疫苗的生產基質，細胞學穩(wěn)定，沒有外源因子污染和致瘤性的危險，且培養(yǎng)簡單、使用代次高。
　　 2．選用滅活工藝生產疫苗。采用經典的甲醛作為滅活劑滅活乙腦病毒，按照1:2000的濃度加入甲醛，在4℃作用28天，通過細胞培養(yǎng)．動物法進行滅活驗證。
　　 3．采用Sepharose6FF凝膠過濾層析純化疫苗，其分離條件溫和、重現(xiàn)性好，還具有較高的回收率。
　　 4．采用細胞蝕斑法代替小鼠法進行病毒滴度檢測