RY10-4逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥性及其抗肺腺癌活性研究.pdf

1、黃酮(flavonoids)大量存在于我們的飲食中，有著優(yōu)良的藥理、保健活性于一體的多種功效。它是一種在草本植物當(dāng)中廣泛存在的化合物，對人類的身體健康起著重要的維系作用。黃酮類化合物不僅可以從基本的日常生活中去調(diào)節(jié)身體機能的基本狀態(tài)，還可以預(yù)防腫瘤以及心血管等重大疾病。近年來隨著科學(xué)水平的深入研究，在臨床治病的角度上來看，有一些黃酮有著純天然且?guī)缀鯚o毒性等特點而廣受人們的青睞。
　　普通針毛蕨主要生長在我國長江以南的位置，是一種金

2、星蕨科針毛蕨屬植物。民間古方中普遍認為該種草本植物在清熱解毒，散結(jié)軟堅方面具有獨特的功效，因此在傳統(tǒng)祖國中醫(yī)學(xué)里，它常常被用來做消除水腫及治療止血之用。這種植物當(dāng)中含有一種特殊的黃酮成分叫做原芹菜素（Protoapigenone）。它在體內(nèi)外的抗癌活性細胞篩選中均有很好的抗瘤表現(xiàn)。Protoapigenone對很多不同來源的癌癥細胞都能夠表現(xiàn)出很明顯的細胞毒作用，因此抗腫瘤譜較為全面，這讓廣大科研工作者為之欣喜。在后續(xù)科學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，一

3、系列的非芳香 B環(huán)的黃酮類化合物例如原芹菜素都有著強大的抗瘤活性。原芹菜素近幾年在多藥耐藥方面也表現(xiàn)出不俗的成績，可以有效的治療和逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥。
　　根據(jù)構(gòu)效關(guān)系研究及相關(guān)文獻的報道，結(jié)合前人對 Protoapigenone的研究基礎(chǔ)，采用化學(xué)全合成的方法合成了毒性更低，藥效更強，含1-hydroxycyclohexa-2,5-dien-4-one基團的新型化合物 RY10-4，其化學(xué)名為2-(1-hydroxy-4-ox

4、o-2,5-cyclohexadien-1-yl)-4H-Pyran-4-one。本課題主要對RY10-4的藥效活性進行了深入研究，主要內(nèi)容包括兩個部分：第一部分主要進行了RY10-4體內(nèi)和體外逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的乳腺癌的作用及其所涉及影響的相關(guān)信號傳遞通路；第二部分主要研究了 RY10-4體外抑制人肺腺癌A549細胞增殖、侵襲以及誘導(dǎo)凋亡的作用，并對其抗肺癌活性相關(guān)的作用機制進行了研究。
　　第一部分：RY10-4體內(nèi)外對多藥耐藥乳

5、腺癌的殺傷及逆轉(zhuǎn)作用研究
　　目的：本實驗在前期工作中證實RY10-4在體外可以誘導(dǎo)乳腺癌細胞MCF-7的凋亡，同時我們在對 RY10-4的一個初步預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，RY10-4作為原芹菜素類似物能逆轉(zhuǎn)阿霉素（Adriamycin, ADR）激活的p-AKT，提示其可能和原芹菜素一樣對阿霉素耐藥的腫瘤細胞也發(fā)揮抗腫瘤作用，在臨床運用上可能具有潛在意義，但RY10-4是否真正具有逆轉(zhuǎn)耐藥作用及可能的作用機制尚不清楚，因此本部分對此進行著

6、重探討。首先，研究 RY10-4在體外水平對乳腺癌多藥耐藥細胞MCF-7/ADR生長增殖的影響；其次，進一步研究RY10-4對化療藥物ADR運用于MCF-7/ADR細胞的敏感性及其對藥物轉(zhuǎn)運相關(guān)功能的改變；然后，我們更進一步探討了RY10-4在逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR多藥耐藥時所涉及的相關(guān)信號傳導(dǎo)通路；最后，在體內(nèi)水平研究了RY10-4對耐藥型乳腺癌的抗腫瘤效應(yīng)及逆轉(zhuǎn)作用。
　　方法：本實驗采用了乳腺癌敏感細胞系MCF-7和對阿霉素

7、耐藥的多藥耐藥細胞系MCF-7/ADR，觀察 RY10-4體內(nèi)和體外抗癌和逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。（1）采用四氮唑鹽還原法（MTT法）繪制細胞生長曲線，觀察RY10-4對MCF-7和MCF-7/ADR細胞生長的影響；采用Annexin V/PI染色法，流式細胞術(shù)檢測RY10-4對細胞MCF-7和MCF-7/ADR凋亡狀態(tài)的改變和影響。（2）采用MTT法體外檢測RY10-4對藥物ADR敏感性的分析，探究細胞MCF-7/ADR在RY10-4作用下對

8、ADR藥物敏感程度的影響。（3）采用羅丹明（Rhodamine）外排實驗檢測MCF-7和MCF-7/ADR細胞膜在RY10-4作用下的藥物轉(zhuǎn)運泵功能的影響；運用Western Blot實驗技術(shù)檢測 MCF-7/ADR細胞在 RY10-4作用下細胞內(nèi) P-gp蛋白表達水平的改變；運用Real-time PCR技術(shù)檢測RY10-4作用后細胞MCF-7/ADR內(nèi)多藥耐藥基因MDR1的轉(zhuǎn)錄水平的改變。（4）通過ATP水平檢測實驗，研究RY10-

9、4對MCF-7/ADR細胞中過量表達的P-gp的影響。（5）通過Western Blot和Real-time PCR等實驗方法檢測RY10-4對MCF-7/ADR細胞內(nèi)Akt，p-Akt，NF-κB蛋白表達的影響，進一步聯(lián)合使用Akt抑制劑LY294002和NF-κB抑制劑PDTC檢測對MDR1基因和P-gp蛋白的影響。（6）運用移植瘤模型研究RY10-4體內(nèi)逆轉(zhuǎn)阿霉素的作用并用HE染色研究腫瘤組織的病理學(xué)改變。
　　結(jié)果：RY1

10、0-4具有很強的逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥作用。（1）細胞生長曲線顯示,化合物RY10-4對敏感株MCF-7細胞及耐藥株MCF-7/ADR細胞均有生長抑制作用，和對照組阿霉素相比，RY10-4可顯著抑制MCF-7/ADR細胞的生長；用流式細胞儀采用Annexin/PI染色法檢測對乳腺癌細胞的凋亡，結(jié)果顯示：RY10-4可顯著誘導(dǎo)MCF-7/ADR細胞的凋亡。（2）MTT法體外分析檢測乳腺癌多藥耐藥細胞對藥物敏感性影響的結(jié)果顯示：MCF-7/AD

11、R細胞雖對ADR耐藥但對RY10-4的細胞毒作用敏感，且RY10-4能夠增強MCF-7/ADR細胞對化療藥物ADR的敏感性，改變耐藥的狀況。（3）羅丹明123外排實驗結(jié)果顯示：RY10-4能夠增高細胞MCF-7/ADR內(nèi)羅丹明潴留量和蓄積量，提示RY10-4可降低MCF-7/ADR細胞膜外排泵的藥物轉(zhuǎn)運功能；Western Blot實驗技術(shù)檢測P-gp蛋白，結(jié)果顯示：RY10-4能夠上調(diào)細胞MCF-7/ADR內(nèi)P-gp蛋白的表達水平；R

12、eal-time PCR對MDR1基因的檢測結(jié)果顯示：RY10-4可以上調(diào)MCF-7/ADR細胞內(nèi)MDR1基因的轉(zhuǎn)錄水平。（4）通過ATP水平檢測實驗顯示：RY10-4可以抑制ATP酶活性，降低ATP的水平從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。（5）通過Western Blot及Real-timePCR方法對逆轉(zhuǎn)耐藥的相關(guān)信號通路蛋白檢測發(fā)現(xiàn)：RY10-4通過抑制 PI3K/Akt/NF-κB信號通路調(diào)控MDR/P-gp介導(dǎo)的耐藥型乳腺癌細胞MCF-7/A

13、DR的多藥耐藥。（6）通過移植瘤模型發(fā)現(xiàn)：RY10-4可以體內(nèi)逆轉(zhuǎn)耐藥型乳腺癌對阿霉素的抵抗，不論單用 RY10-4還是聯(lián)用ADR均能使組織中的腫瘤細胞死亡，表現(xiàn)出強大的抗癌效應(yīng)和逆轉(zhuǎn)耐藥效力。
　　結(jié)論：RY10-4作為原芹菜素類似物，一方面可抑制耐藥的乳腺癌細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，下調(diào) ATP水平并抑制 P-gp的外排功能，另一方面可通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路，下調(diào)MDR1/P-gp的表達，逆轉(zhuǎn)MCF-7/AD

14、R的多藥耐藥，而且體內(nèi)水平也可以抑制耐藥型乳腺癌腫瘤組織的生長情況。因此，RY10-4在體內(nèi)水平以及體外水平均表現(xiàn)出抗癌和逆轉(zhuǎn)耐藥的雙重作用。在前期研究中，RY10-4的抗乳腺癌作用雖然已經(jīng)做出了比較深入的研究，但本課題首次報道并驗證了RY10-4具有逆轉(zhuǎn)耐ADR乳腺癌的多藥耐藥作用，首次考察了RY10-4逆轉(zhuǎn)耐藥的分子機制，并且沒有明顯的毒副作用，在保證了強大的逆轉(zhuǎn)耐藥作用同時特保證了其應(yīng)用的安全性，可以說RY10-4比傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)劑維

15、拉帕米（Verapamil）在逆轉(zhuǎn)多藥耐藥方面有更明顯的優(yōu)勢。我們的實驗研究結(jié)果也提示了兩個逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的潛在靶點：NF-κB及Akt。本實驗的研究內(nèi)容為RY10-4今后在臨床上的抗癌運用（與化療藥聯(lián)合使用或者單獨使用）治療腫瘤多藥耐藥提供了寶貴的指導(dǎo)基礎(chǔ)。
　　第二部分：RY10-4體外抗肺腺癌活性研究
　　目的：本部分在體外水平研究RY10-4化合物抑制人源肺腺癌細胞A549的增殖作用，探究藥物RY10-4在體外抗肺腺癌

16、的藥效活性，同時研究其抗肺腺癌藥效活性所涉及的相關(guān)分子機制及信號通路。
　　方法：本實驗選用人肺腺癌細胞株 A549，觀察 RY10-4體外抗肺癌作用。（1）運用MTT法和臺盼藍拒染法研究RY10-4抑制A549細胞體外增殖的作用。（2）運用Annexin V/PI雙染法并用流式細胞儀進行檢測、Hoechst33258熒光染色法，同時研究RY10-4對誘導(dǎo)肺腺癌A549細胞凋亡的作用。（3）通過 PI染色法流式細胞儀分析 RY10

17、-4對細胞周期的阻滯作用。（4）通過 Transwell法來評價 RY10-4對A549細胞體外侵襲能力的影響。（5）運用Western Blot實驗方法檢測RY10-4對凋亡侵襲相關(guān)蛋白及相關(guān)通路蛋白表達水平的影響。（6）用流式細胞儀檢測RY10-4對活性氧自由基（ROS）的影響。
　　結(jié)果：RY10-4在體外表現(xiàn)出很強的抗肺腺癌活性。（1）RY10-4可以顯著抑制A549細胞體外增殖活性。（2）RY10-4可以顯著誘導(dǎo) A54

18、9細胞凋亡，染色法中經(jīng)過RY10-4處理過的細胞呈現(xiàn)出明顯的凋亡細胞的形態(tài)特征，凋亡細胞比率增高，且經(jīng)STAT3抑制劑AG490預(yù)處理可以顯著促進RY10-4誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)。（3）RY10-4處理后，細胞的G1期細胞比率顯著增加。（4）當(dāng)A549細胞使用不同濃度RY10-4干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，能夠透過聚碳酸酯膜的細胞也梯度性減少，說明A549的侵襲行為受到了RY10-4的明顯抑制。（5）在RY10-4處理后的A549細胞中我們檢測到，線粒體中的

19、細胞色素 C向胞漿位置釋放，線粒體凋亡途徑被激活，P38、ERK信號傳導(dǎo)通路被磷酸化活化。A549細胞被抑制劑預(yù)處理后，則發(fā)現(xiàn)U0126（ERK特異性抑制劑）及AG490（STAT3特異性抑制劑）明顯地能夠促進化合物RY10-4所誘導(dǎo)的細胞凋亡現(xiàn)象，而 SB203580（P38特異性抑制劑）則抑制了 RY10-4誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)。（6）RY10-4處理后可顯著增高ROS水平，且與U0126及AG490聯(lián)用可進一步協(xié)同增高ROS水平，而聯(lián)用