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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
1.探究柚皮苷對(duì)大鼠廢用性骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用。
2.探究柚皮苷是否通過(guò)促進(jìn)骨膜素(Periostin)和Semphorin3A(Sema3A)表達(dá),進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,從而預(yù)防廢用性骨質(zhì)疏松的發(fā)生。
3.體外實(shí)驗(yàn)條件下,探究柚皮苷是否通過(guò)促進(jìn)骨膜素表達(dá),進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。
方法:
1.選取6個(gè)月齡雄性SD大鼠
2、90只,隨機(jī)分為5組,每組18只:正常對(duì)照組(Control),單純骨質(zhì)疏松造模組和低、中、高劑量柚皮苷預(yù)防組,后4組通過(guò)鼠尾懸吊4周建立廢用性骨質(zhì)疏松模型,后3組分別于造模前4周和造模后4周灌服30mg·kg-1·d-1,100mg·kg-1·d-1和300mg·kg-1·d-1柚皮苷,前2組灌服等量生理鹽水。造模4周后處死取材,取各組大鼠血清進(jìn)行骨代謝指標(biāo)I型膠原C端肽(CTX-1)和I型前膠原氨基端肽(P1NP)檢測(cè),取各組大鼠股
3、骨,檢測(cè)股骨干和股骨頸生物力學(xué)性能,測(cè)量股骨遠(yuǎn)端骨密度(BMD),對(duì)各組大鼠股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行Micro-CT掃描、蘇木素-伊紅染色液(HE)染色、骨鈣素(osteocalcin,OCN)免疫組化染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。
2.取各組脛骨,通過(guò) RT-PCR和 qRT-PCR檢測(cè)脛骨中 Sema3A、Neuropilin-1(NRP1)、骨膜素、骨硬化蛋白(Sclerostin)和β-catenin的 mRNA水平,
4、通過(guò)Western-blot檢測(cè)Sema3A、骨膜素、骨硬化蛋白和細(xì)胞核β-catenin蛋白的表達(dá)情況,并對(duì)各組股骨行Sema3A、骨膜素和骨硬化蛋白免疫組化染色。
3.體外培養(yǎng)小鼠成骨前體樣細(xì)胞MC3T3-E1,分為空白對(duì)照組,以及0.2ng/ml、2ng/ml、20ng/ml、100ng/ml柚皮苷處理組,檢測(cè)各組堿性磷酸酶(ALP)的活性以篩選出促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的最佳柚皮苷濃度。相對(duì)于空白對(duì)照組,在最佳濃度柚皮苷刺激下
5、,通過(guò)PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞分化特異性基因BMP-2、OCN和Runx2的表達(dá)情況,通過(guò)PCR和Western-blot檢測(cè)Sema3A、骨膜素以及β-catenin的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。觀察骨膜素特異性抗體能否抑制柚皮苷促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP活性的上調(diào)。
結(jié)果:
1.造模4周后,相對(duì)于正常對(duì)照組,單純?cè)炷=M股骨力學(xué)性能和股骨遠(yuǎn)端BMD顯著下降,股骨遠(yuǎn)端骨小梁微結(jié)構(gòu)遭到顯著破壞,單純?cè)炷=M血清P1NP顯著下降,CTX-
6、1顯著上升,股骨遠(yuǎn)端成骨細(xì)胞OCN免疫組化強(qiáng)度顯著下降,股骨遠(yuǎn)端TRAP染色顯示破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加。100mg·kg-1·d-1和300mg·kg-1·d-1柚皮苷能夠顯著預(yù)防懸吊引起的股骨力學(xué)性能下降和骨密度降低,并改善懸吊破壞的骨小梁微結(jié)構(gòu),中、高劑量柚皮苷能夠顯著上調(diào)血清P1NP水平,下調(diào)CTX-1,并顯著增強(qiáng)股骨遠(yuǎn)端OCN的免疫組化強(qiáng)度,減少小梁周圍破骨細(xì)胞數(shù)量。
2.造模4周后,相對(duì)于正常對(duì)照組,脛骨Sema3A、
7、骨膜素和核β-catenin的表達(dá)水平顯著下降,骨硬化蛋白表達(dá)顯著增加,股骨免疫組化染色顯示骨外膜成骨細(xì)胞分泌的骨膜素顯著減少,股骨遠(yuǎn)端成骨細(xì)胞分泌的Sema3A顯著下調(diào),股骨干骨細(xì)胞骨硬化蛋白免疫染色陽(yáng)性強(qiáng)度顯著上升。相對(duì)于單純?cè)炷=M,中、高劑量柚皮苷顯著增加脛骨Sema3A、骨膜素與核β-catenin的表達(dá)水平,減少骨硬化蛋白表達(dá),股骨免疫組化染色顯示骨外膜成骨細(xì)胞分泌的骨膜素顯著增加,股骨遠(yuǎn)端成骨細(xì)胞分泌的Sema3A顯著上調(diào),
8、股骨干骨硬化蛋白免疫染色陽(yáng)性強(qiáng)度顯著下降。
3.相對(duì)于空白對(duì)照組,20ng/ml柚皮苷促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的能力最強(qiáng),20ng/ml柚皮苷顯著促進(jìn) BMP-2、OCN、Runx2、Sema3A、骨膜素、Nrp1和β-catenin的mRNA的表達(dá),Western-blot結(jié)果顯示20ng/ml柚皮苷顯著增加Sema3A、骨膜素和核β-catenin蛋白的表達(dá)。骨膜素特異性抗體能夠抑制20ng/ml柚皮苷對(duì)成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。<
9、br> 結(jié)論:
1.柚皮苷具有促進(jìn)骨形成并抑制骨重吸收的雙重作用,能夠預(yù)防大鼠廢用性骨質(zhì)疏松的發(fā)生。
2.柚皮苷可能是通過(guò)上調(diào)骨膜素,進(jìn)而下調(diào)骨硬化蛋白,從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,以及上調(diào)Semaphorin3A進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路這兩條信號(hào)路徑促進(jìn)骨質(zhì)合成。
3.柚皮苷可能通過(guò)上調(diào)成骨前體樣細(xì)胞中骨膜素的表達(dá),以自分泌或旁分泌的方式激活Wnt/β-catenin信
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