柚皮苷對(duì)廢用性骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　1.探究柚皮苷對(duì)大鼠廢用性骨質(zhì)疏松的預(yù)防作用。
　　2.探究柚皮苷是否通過(guò)促進(jìn)骨膜素(Periostin)和Semphorin3A(Sema3A)表達(dá)，進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而預(yù)防廢用性骨質(zhì)疏松的發(fā)生。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)條件下，探究柚皮苷是否通過(guò)促進(jìn)骨膜素表達(dá)，進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。
　　方法：
　　1.選取6個(gè)月齡雄性SD大鼠

2、90只，隨機(jī)分為5組，每組18只：正常對(duì)照組(Control)，單純骨質(zhì)疏松造模組和低、中、高劑量柚皮苷預(yù)防組，后4組通過(guò)鼠尾懸吊4周建立廢用性骨質(zhì)疏松模型，后3組分別于造模前4周和造模后4周灌服30mg·kg-1·d-1，100mg·kg-1·d-1和300mg·kg-1·d-1柚皮苷，前2組灌服等量生理鹽水。造模4周后處死取材，取各組大鼠血清進(jìn)行骨代謝指標(biāo)I型膠原C端肽(CTX-1)和I型前膠原氨基端肽(P1NP)檢測(cè)，取各組大鼠股

3、骨，檢測(cè)股骨干和股骨頸生物力學(xué)性能，測(cè)量股骨遠(yuǎn)端骨密度(BMD)，對(duì)各組大鼠股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行Micro-CT掃描、蘇木素-伊紅染色液(HE)染色、骨鈣素(osteocalcin，OCN)免疫組化染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。
　　2.取各組脛骨，通過(guò) RT-PCR和 qRT-PCR檢測(cè)脛骨中 Sema3A、Neuropilin-1(NRP1)、骨膜素、骨硬化蛋白(Sclerostin)和β-catenin的 mRNA水平，

4、通過(guò)Western-blot檢測(cè)Sema3A、骨膜素、骨硬化蛋白和細(xì)胞核β-catenin蛋白的表達(dá)情況，并對(duì)各組股骨行Sema3A、骨膜素和骨硬化蛋白免疫組化染色。
　　3.體外培養(yǎng)小鼠成骨前體樣細(xì)胞MC3T3-E1，分為空白對(duì)照組，以及0.2ng/ml、2ng/ml、20ng/ml、100ng/ml柚皮苷處理組，檢測(cè)各組堿性磷酸酶(ALP)的活性以篩選出促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的最佳柚皮苷濃度。相對(duì)于空白對(duì)照組，在最佳濃度柚皮苷刺激下

5、，通過(guò)PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞分化特異性基因BMP-2、OCN和Runx2的表達(dá)情況，通過(guò)PCR和Western-blot檢測(cè)Sema3A、骨膜素以及β-catenin的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。觀察骨膜素特異性抗體能否抑制柚皮苷促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP活性的上調(diào)。
　　結(jié)果：
　　1.造模4周后，相對(duì)于正常對(duì)照組，單純?cè)炷＝M股骨力學(xué)性能和股骨遠(yuǎn)端BMD顯著下降，股骨遠(yuǎn)端骨小梁微結(jié)構(gòu)遭到顯著破壞，單純?cè)炷＝M血清P1NP顯著下降，CTX-

6、1顯著上升，股骨遠(yuǎn)端成骨細(xì)胞OCN免疫組化強(qiáng)度顯著下降，股骨遠(yuǎn)端TRAP染色顯示破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加。100mg·kg-1·d-1和300mg·kg-1·d-1柚皮苷能夠顯著預(yù)防懸吊引起的股骨力學(xué)性能下降和骨密度降低，并改善懸吊破壞的骨小梁微結(jié)構(gòu)，中、高劑量柚皮苷能夠顯著上調(diào)血清P1NP水平，下調(diào)CTX-1，并顯著增強(qiáng)股骨遠(yuǎn)端OCN的免疫組化強(qiáng)度，減少小梁周圍破骨細(xì)胞數(shù)量。
　　2.造模4周后，相對(duì)于正常對(duì)照組，脛骨Sema3A、

7、骨膜素和核β-catenin的表達(dá)水平顯著下降，骨硬化蛋白表達(dá)顯著增加，股骨免疫組化染色顯示骨外膜成骨細(xì)胞分泌的骨膜素顯著減少，股骨遠(yuǎn)端成骨細(xì)胞分泌的Sema3A顯著下調(diào)，股骨干骨細(xì)胞骨硬化蛋白免疫染色陽(yáng)性強(qiáng)度顯著上升。相對(duì)于單純?cè)炷＝M，中、高劑量柚皮苷顯著增加脛骨Sema3A、骨膜素與核β-catenin的表達(dá)水平，減少骨硬化蛋白表達(dá)，股骨免疫組化染色顯示骨外膜成骨細(xì)胞分泌的骨膜素顯著增加，股骨遠(yuǎn)端成骨細(xì)胞分泌的Sema3A顯著上調(diào)，

8、股骨干骨硬化蛋白免疫染色陽(yáng)性強(qiáng)度顯著下降。
　　3.相對(duì)于空白對(duì)照組，20ng/ml柚皮苷促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的能力最強(qiáng)，20ng/ml柚皮苷顯著促進(jìn) BMP-2、OCN、Runx2、Sema3A、骨膜素、Nrp1和β-catenin的mRNA的表達(dá)，Western-blot結(jié)果顯示20ng/ml柚皮苷顯著增加Sema3A、骨膜素和核β-catenin蛋白的表達(dá)。骨膜素特異性抗體能夠抑制20ng/ml柚皮苷對(duì)成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。<

9、br>　　結(jié)論：
　　1.柚皮苷具有促進(jìn)骨形成并抑制骨重吸收的雙重作用，能夠預(yù)防大鼠廢用性骨質(zhì)疏松的發(fā)生。
　　2.柚皮苷可能是通過(guò)上調(diào)骨膜素，進(jìn)而下調(diào)骨硬化蛋白，從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，以及上調(diào)Semaphorin3A進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路這兩條信號(hào)路徑促進(jìn)骨質(zhì)合成。
　　3.柚皮苷可能通過(guò)上調(diào)成骨前體樣細(xì)胞中骨膜素的表達(dá)，以自分泌或旁分泌的方式激活Wnt/β-catenin信