番茄藍光受體CRY1和CRY2基因沉默和過量表達植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因番茄研究.pdf

1、對于隱花色素的研究，在植物中主要是集中在對擬南芥的研究上，番茄隱花色素的研究目前有兩篇報道，一篇是對CRYl的CCT進行反義操作后發(fā)現(xiàn)在藍光下轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出了長胚軸，在紅光下卻沒有這樣的表型?；ㄇ嗨販p少，而葉綠素和二級向光性曲率卻沒有發(fā)生變化。另一篇則是對CRY2的過量表達，無論是在弱藍光還是強藍光下其節(jié)間都變短了，并且其葉子花青素和葉綠素含量同果實中的類黃酮和番茄紅素含量都增加了。并且花期推遲，葉腋的分枝變得發(fā)達。本研究主要是通過構(gòu)

2、建番茄藍光受體CRY1和CRY2基因基因沉默和過量表達植物表達載體，并以根癌農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化番茄，以得到轉(zhuǎn)基因植株。為進一步研究番茄隱花色素的功能，特別是對與番茄紅素調(diào)控有關的基因功能進一步研究奠定基礎。 本研究共分兩部分：(1)番茄藍光受體CRY1和CRY2基因基因沉默和過量表達植物表達載體的構(gòu)建。通過基因重組技術構(gòu)建了pBI121fsp—CRY1RNAi，pHB—CRY1RNAi，pHB—CRY10X，DHB—CRY2RNA

3、i，pBI121fsp—CRY20X共五個植物表達載體。此部分內(nèi)容主要包括以下研究：①提取番茄總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得有關cDNA；②設計引物，通過PCR擴增得到用于構(gòu)建載體所需的帶有特異限制性內(nèi)切酶位點的基因片斷；③對于RNAi表達載體，需要先構(gòu)建到中間表達載體pSK上；④對于RNAi植物表達載體，通過BamH I和Sac I對連接在中間載體pSK上的重組子進行雙酶切再連接到經(jīng)同樣雙酶切的pHB和pBI121fsp植物雙元載體質(zhì)粒上。而對

4、于過量表達載體則直接利用帶酶切位點的引物對PCR產(chǎn)物直接用于植物表達載體連接。pHB質(zhì)粒是受CaMV35s啟動子驅(qū)動，pBI121fsp質(zhì)粒則是受番茄中一個在果實中特異表達基因(Lefsm1)的啟動子的驅(qū)動。⑤連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組子被命名為pBI121fsp—CRY1RNAi，pHB—CRY1RNAi，pHB-CRY10x，pHB-CRY2RNAi，pBI121fsp-CRY20X。⑥通過凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105

5、中。經(jīng)酶切鑒定及PCR擴增檢測，結(jié)果顯示重組植物表達載體pBI121fsp-CRY1RNAi，pHB-CRY1RNAi，pHB-CRY10X，pHB-CRY2RNAi，pBI121fsp-CRY20X已成功構(gòu)建，基因分別正確插入到載體pHB中CaMV35s啟動子與Nos3'轉(zhuǎn)錄終止子和pBI121果實特異啟動子與Nos3'終止子之間的多克隆位點中。(2)根癌農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化番茄的研究。以根癌農(nóng)桿菌葉盤轉(zhuǎn)化法將基因?qū)敕选０?項實驗研

6、究：①植物材料的準備。以10％次氯酸鈉溶液消毒番茄種子，發(fā)芽后取6～8天齡子葉做預培養(yǎng)；②根癌農(nóng)桿菌接種于含Rif(20mg/L)及Kin(100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)過夜。③根癌農(nóng)桿菌介導質(zhì)粒pBI121fsp-CRY1RNAi，pHB-CRY1RNAi，pHB-CRY10X。pHB-CRY2RNAi，pBI121fsp-CRY20X轉(zhuǎn)化番茄子葉，轉(zhuǎn)化通過農(nóng)桿菌與切成小塊的番茄子葉共培養(yǎng)、分化選擇