草魚白細胞介素10的免疫調節(jié)功能及其作用機制研究.pdf

1、在哺乳動物免疫系統(tǒng)中，白細胞介素10（Interleukin-10，IL-10）被認為是具有多重功能的重要細胞因子。IL-10由多種細胞分泌并作用于各種免疫細胞，如T細胞、B細胞、單核/巨噬細胞和樹突狀細胞，調控這些細胞的生長、成熟、增殖、分化與活化，進而影響機體的天然免疫和獲得性免疫，并與其它細胞因子一起維持了免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。
　　硬骨魚 IL-10在多種魚類包括斑馬魚、金魚、鯉魚和虹鱒中被克隆鑒定，但有關硬骨魚 IL-10的免

2、疫調節(jié)功能知之甚少，其受體和細胞信號傳導途徑，以及作用機制均有待闡明。本論文研究草魚 IL-10的免疫學功能，不僅揭示其保守的抑炎癥功能，而且闡明它和另一經典抑炎癥細胞因子 TGF-β1參與免疫反應調節(jié)的相互關系和作用機制，從而拓展了對魚類 IL-10免疫學地位的認識。另外，為了解草魚IL-10發(fā)揮作用的分子機制，進一步鑒定了草魚IL-10介導的IL-10受體1（IL-10R1）和IL-10受體2（IL-10R2）及其下游信號通路（ST

3、AT3）和靶基因細胞因子信號轉導負調控蛋白3（Suppressor of cytokine signaling3，SOCS3）。為獲悉草魚IL-10的產生機制，初步探討了LPS和IFN-γ對草魚IL-10的轉錄調控機制。具體研究內容如下：
　　1.重組草魚IL-10蛋白的活性鑒定和參與的免疫刺激作用：（1）通過硬骨魚同源序列比對克隆獲得草魚IL-10 cDNA全長序列，并用生物信息學方法分析其結構域與保守特性。（2）實時熒光定量P

4、CR（qPCR）方法檢測草魚IL-10在各組織中的表達，結果表明草魚 IL-10主要在免疫相關組織頭腎、腎、鰓中有較高表達，提示草魚 IL-10可能參與免疫相關反應。（3）構建原核表達系統(tǒng)并采用親和純化法獲得高純度重組草魚IL-10蛋白，利用此蛋白研究草魚IL-10免疫學功能。（4）細胞活性檢測結果表明草魚IL-10能夠促進外周血淋巴細胞PBLs的細胞活性。相似地，轉化生長因子β1（Transforming growth factorβ

5、1，TGF-β1）也能促進PBLs的細胞活性。（5）為揭示上述作用的機制，采用草魚IL-10免疫中和實驗發(fā)現(xiàn)草魚TGF-β1是依賴于IL-10發(fā)揮上調PBLs細胞活性的作用。（6）上述結論得到進一步支持，即qPCR和競爭抑制酶聯(lián)免疫吸附（CI-ELISA）實驗表明草魚TGF-β1促進IL-10的mRNA表達和蛋白分泌水平，從而證明TGF-β1可能通過誘導IL-10的產生來上調PBLs的細胞活性。本章證明了重組草魚IL-10的免疫刺激作用

6、，特別是揭示了魚類TGF-β1和IL-10在發(fā)揮免疫刺激作用中的上下游關系。
　　2.草魚IL-10和TGF-β1在炎癥反應調節(jié)中的作用和相互關系：（1）在草魚頭腎單核/巨噬細胞中，加入的草魚IL-10和TGF-β1均抑制LPS刺激促炎癥信號因子TNF-α、IL-1β、iNOS和IL-8的表達。（2）相反地，草魚IL-10和TGF-β1的抗體均放大LPS對上述促炎癥信號因子mRNA的上調作用，提示內源的IL-10與 TGF-β1發(fā)

7、揮了抑制促炎癥因子表達的作用。（3）機制研究發(fā)現(xiàn)，草魚 IL-10與TGF-β1均能促進草魚IκBα全蛋白的表達,即抑制IκBα的降解從而抑制NF-κB通路的激活，表明草魚TGF-β1和IL-10可能通過抑制NF-κB信號通路控制LPS誘導的促炎癥因子表達。（4）草魚IL-10抗體和TGF-β1抗體分別對TGF-β1和IL-10的調節(jié)作用不產生影響，提示在 LPS激活的頭腎單核/巨噬細胞中，TGF-β1與IL-10獨立發(fā)揮抑制功能。這些

8、結果驗證了魚類IL-10的抑炎癥作用及其機制，以及與另一抑炎癥因子 TGF-β1平行發(fā)揮作用的關系，從而豐富了魚類炎癥反應控制機制的知識。
　　3.草魚 IL-10受體及信號通路的鑒定：(1)采用同源克隆技術獲得了草魚IL-10受體1（IL-10R1）、細胞因子受體家族成員4（cytokine receptor family member4，CRFB4）以及細胞因子受體家族成員5（CRFB5），并進行了生物信息學分析。（2）qPC

9、R檢測結果表明草魚IL-10R1表達于鰓、胸腺、脾、頭腎等免疫相關組織，而草魚CRFB4與CRFB5則廣泛表達于各檢測組織，展現(xiàn)出與哺乳動物同系基因類似的表達特性。（3）構建這三種受體的真核表達質粒，在草魚腎細胞系CIK中，通過對STAT3控制的熒光素酶的活性檢測，證明了草魚IL-10R1在IL-10信號傳導中的必要地位，以及草魚IL-10能夠上調STAT3的活性。更重要的，首次證明了CRFB4而不是CRFB5作為草魚IL-10R2。（

10、4）分離克隆草魚SOCS3啟動子區(qū)域，并構建草魚SOCS3啟動子熒光素酶報告質粒及其STAT結合位點的突變體，熒光素酶的活性檢測表明草魚STAT3介導IL-10對SOCS3啟動子活性的上調作用。（5）在原代細胞草魚頭腎白細胞HKLs中，免疫印跡和qPCR結果證明草魚IL-10激活STAT3信號通路并介導SOCS3 mRNA的表達。這些工作闡明了草魚IL-10調節(jié)靶基因SOCS3轉錄的IL-10R1/CRFB4/STAT3信號通路。

11、>　　4、草魚 IL-10的轉錄調控分析：（1）在草魚頭腎單核/巨噬細胞中，LPS通過MAPK/ERK和NF-κB信號通路上調IL-10 mRNA表達。（2）在草魚頭腎單核/巨噬細胞中，重組草魚 IFN-γ抑制 IL-10 mRNA的表達，參與的信號通路為MAPK/ERK。（3）LPS上調草魚IL-10啟動子活性，而重組草魚IFN-γ抑制IL-10啟動子的活性。這些實驗結果表明，不同的刺激作用通過不同的信號途徑調控IL-10的表達。

12、r>　　本論文揭示了草魚 IL-10的免疫調節(jié)功能，包括刺激免疫細胞活性的新發(fā)現(xiàn)和在炎癥反應中的經典抑制功能，特別明確了兩種重要抑炎癥因子 IL-10與TGF-β1在上述調節(jié)作用中的相互關系和作用機制，鑒定了草魚IL-10的特異受體IL-10R1和輔助受體 CRFB4，闡明了草魚 IL-10激活 STAT3信號通路和靶基因SOCS3，且探討了不同誘導條件下 IL-10的轉錄調控機制。本論文的結果不僅填補了硬骨魚 IL-10功能特性、相關