基于非天然氨基酸的蛋白質定點同位素標記及NMR研究.pdf

1、在生命體中存在的蛋白質由20種天然氨基酸組成，具有廣泛的種類和作用，是生物體行使其功能最重要的大分子之一。近年來，利用非天然氨基酸(Unnaturalamino acid，UAA)標記蛋白位點，對蛋白進行修飾的方法得到廣泛應用。通過不同方法將UAA引入到蛋白中，為人們進一步了解蛋白質結構、蛋白間相互作用、蛋白動力學以及修飾改造蛋白質等方面研究提供了行之有效的方法。本論文共分為四章。
　　第一章首先介紹了非天然氨基酸的合成方法，即通

2、過有機合成或通過酶催化法合成非天然氨基酸。有機合成法是大量獲得（毫克級到克級）非天然氨基酸的有效手段。而酶催化法利用TPL酶或其突變體，用于一些酪氨酸類似非天然氨基酸的合成，是有機合成法的補充。然后，依據非天然氨基酸功能介紹他們的分類情況，包括化學活性類、翻譯后修飾類、生物物理探針類、金屬螯合類等。通過已有報道，闡明了非天然氨基酸的重要性。最后，簡要介紹了非天然氨基酸標記蛋白質的方法，主要是氨基酸特異性和位點特異性表達含有非天然氨基酸的

3、蛋白質。雖然化學合成法是獲得均一性蛋白質的不錯選擇，但多數報道中，獲得非天然氨基酸標記的蛋白質方法主要是通過細胞表達獲取。
　　第二章首先介紹了光敏非天然氨基酸(photo-caged amino acid)的應用。利用賴氨酸、絲氨酸、酪氨酸和半胱氨酸側鏈的化學活性與鄰硝基芐基類基團連接，得到含有photo-cage的非天然氨基酸。它們通過位點特異性引入目的蛋白的活性位點后，可以封閉蛋白酶的活性。經過紫外光照射可以將光敏感基團脫除

4、，從而得到和天然蛋白酶無任何差異的活性蛋白酶，達到調控酶活性的目的。該方法可以調控蛋白表達、信號傳導等多種生物過程。之后介紹了由酪氨酸發(fā)展得到的光敏感非天然氨基酸oNBTyr，講述了oNBTyr利用密碼子擴增方法位點特異性引入蛋白的發(fā)展過程。
　　第三章中，先簡單介紹了液體核磁共振技術應用于蛋白質研究的基本方法。在核磁共振研究中，經常只需要針對一個位點的信號變化進行分析即可。所以在拿到相關譜圖后，我們往往需要進行繁瑣且復雜的信號峰

5、歸屬工作。如果能發(fā)展出一種在不影響蛋白結構和功能的情況下，對蛋白單一位點進行同位素標記的方法，那么將極大地簡化核磁分析過程。以酪氨酸位點的核磁分析為例，我們首先優(yōu)化了oNBTyr的化學合成，合成產率由原先的21％提高至81％。隨后，利用15N-oNBTyr分別標記在GB1和PYL10蛋白的酪氨酸位點(GB1-33Tyr和PYL10-116Tyr)，并在光照脫光敏基團后進行核磁數據采集和分析。證明了利用光敏非天然氨基酸進行蛋白質酪氨酸位點

6、同位素標記的可行性。為其他類似的光敏非天然氨基酸應用提供了借鑒。
　　第四章介紹了已有報道的熒光類非天然氨基酸的化學合成方法以及他們的應用。著重介紹了非天然氨基酸Anap的發(fā)展，以及L，D-Anap的合成方法。Anap首次被Peter Schultz于2009年報道，其合成路線復雜、產率低(8.5％)，而且其合成得到的是D，L-Anap（外消旋體）。我們設計出了合成手性異構的L-Anap合成路線，以2-溴代萘和N-三苯甲基-絲氨酸