芳香基硫酸酯酶抑制劑的篩選及應(yīng)用初探.pdf

1、芳香基硫酸酯酶(ARS)是一類水解芳香基硫酸酯的酶，在9種已知的芳香基硫酸酯酶中，ARSA和ARSB廣泛分布于人體各個(gè)器官和組織中。芳香基硫酸酯酶活性的變化與組織細(xì)胞內(nèi)生理和病理?xiàng)l件的改變具有密切的相關(guān)性。在多種惡性疾病和腫瘤病癥中，芳香基硫酸酯酶活力都呈現(xiàn)顯著的升高，它作為標(biāo)志物在臨床診斷中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。而芳香基硫酸酯酶作為腫瘤治療的靶點(diǎn)還尚待研究。本課題旨在建立一種簡(jiǎn)便快速、高效靈敏的芳香基硫酸酯酶抑制劑篩選模型和藥效檢測(cè)模型

2、，即根據(jù)改進(jìn)的芳香基硫酸酯酶活性的測(cè)試方法，建立并優(yōu)化篩選體系;采用該篩選體系對(duì)經(jīng)過(guò)預(yù)選的多種天然產(chǎn)物進(jìn)行篩選;結(jié)合酶學(xué)和細(xì)胞能量代謝水平的檢測(cè)，以獲得對(duì)腫瘤細(xì)胞中芳香基硫酸酯酶ARS有顯著影響的天然產(chǎn)物小分子抑制劑，并研究芳香基硫酸酯酶抑制劑對(duì)于腫瘤細(xì)胞整體的影響。
　　 本課題通過(guò)測(cè)試肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、PC-9、A427的芳香基硫酸酯酶活性，由于A549細(xì)胞ARS酶活力明顯高于其他兩株細(xì)胞系，而選擇通過(guò)A549細(xì)胞裂解總蛋

3、白的方式獲得芳香基硫酸酯酶，并根據(jù)現(xiàn)有的酶活力測(cè)試方法，改進(jìn)并建立了用于篩選芳香基硫酸酯酶抑制劑的方法。該方法利用4-MUS為底物，在365nm波長(zhǎng)下激發(fā)，通過(guò)讀取450nm波長(zhǎng)下發(fā)射光數(shù)值后計(jì)算比較可篩選芳香基硫酸酯酶抑制劑。此后本課題通過(guò)以Frex-Mit、Frex-Cyt質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-9細(xì)胞系的方式，獲得了能在500nm下激發(fā)，在530nm下發(fā)射熒光而反映細(xì)胞內(nèi)NADH代謝強(qiáng)度的細(xì)胞系。通過(guò)Gefitinib藥物作用，驗(yàn)證了這一生

4、物探針在PC-9細(xì)胞中的靈敏性，并且檢測(cè)到PC-9胞漿內(nèi)NADH代謝的顯著變化。通過(guò)此技術(shù)手段，建立了能夠快速檢測(cè)候選藥物對(duì)于腫瘤細(xì)胞影響效果的模型。通過(guò)對(duì)121種天然產(chǎn)物小分子的篩選，初步獲得了2種較有研究?jī)r(jià)值的天然產(chǎn)物小分子3-G6和4-H(1)1。在1μM和10μM濃度下利用這兩種天然產(chǎn)物小分子對(duì)A427、A549和PC-9細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞woundhealing實(shí)驗(yàn)，這兩種天然產(chǎn)物小分子在1μM下對(duì)細(xì)胞劃痕愈合速率產(chǎn)生的影響不顯著