五味子多糖的結構、生物活性及免疫機制研究.pdf

1、五味子為木蘭科五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill)的干燥成熟果實，具有食用和藥用價值，已有2000多年的應用歷史，列入可用于保健食品的物品名單。五味子中含有木脂素、多糖、揮發(fā)油等多種活性成分，其中木脂素已得到廣泛應用，而多糖未被利用。研究發(fā)現(xiàn)，多糖作為一類天然大分子化合物，具有多種生物活性，如機體免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗衰老等，且對機體正常細胞和組織的毒性極小，因此，已成為天然產物研究的熱點之一。目前

2、，已有多種多糖作為保健食品和食品添加劑、廣譜的免疫促進劑和腫瘤綜合治療中的輔助藥物得到了廣泛的應用。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，五味子粗多糖具有免疫調節(jié)，對環(huán)磷酰胺(CTX)減毒和抗腫瘤等作用，具有廣泛的應用前景。但目前關于五味子多糖的研究多集中于粗多糖，而對于五味子多糖組分結構的全面深入研究、免疫調節(jié)作用、對5-Fu減毒作用、抗腫瘤作用及其免疫機制等方面都鮮有報道。因此，本文以一種低分子量五味子多糖為研究對象，運用現(xiàn)代分析方法(GC-MS

3、，NMR，TEM，AFM，CD等)對該多糖組分的結構進行全面分析;通過免疫抑制小鼠模型，對該組分多糖的免疫調節(jié)作用進行研究，發(fā)現(xiàn)其對機體有較好的免疫調節(jié)作用，同時前期研究結果表明該多糖組分對腫瘤細胞無直接殺傷作用，因此進一步研究其對5-Fu減毒作用和體內抗肝癌活性;通過活性研究結果，推測該多糖組分主要是通過調節(jié)機體免疫來發(fā)揮其生物活性的，由此進一步探討其免疫調節(jié)的機制。本研究揭示該五味子多糖組分的結構特征，并闡明其免疫調節(jié)機制，為五味子

4、多糖功效成分的研究與應用提供基礎數據，為五味子多糖類保健食品和食品添加劑的研究開發(fā)提供科學依據，并為五味子資源的高效利用提供新途徑，該研究對人類健康和社會經濟發(fā)展具有重要意義。
　　 主要研究內容如下:
　　 (1)以低分子量五味子多糖組分(SCPP11)為研究對象，通過甲基化、GC-MS、1HNMR、13CNMR、1H-1HCOSY譜、HSQC譜及HMBC譜等化學分析手段和物理技術對SCPP11的一級化學結構進行推斷和

5、解析，確定了低分子量五味子多糖組分SCPP11的一級結構的重復單元為:→4)-a-D-Glcp(1}4→｛6)-a-D-Galp(1}2→6)-β-D-Manp(1→4)-β-D-Galp(1→{4)-a-D-Glcp(1}4→β-D-Glcp(1→4)-a-D-Glcp(1→4采用CD、AFM、TEM和SEM等方法對SCPP11的構象和分子形貌進行研究。發(fā)現(xiàn)在不同的外界條件下（處理溫度、pH值、加入Ca2+離子、6mol/L的變性劑U

6、rea和等量的80μM的剛果紅溶液），SCPP11的CD譜圖發(fā)生顯著變化，表明外界條件的改變可影響其立體構象和非對稱性。用激光光散射粒度儀測定了SCPP11的粒度，結果表明SCPP11的粒徑為270nm，分散度為0.129，粒度分布較均勻。通過多角度激光光散射得到SCPP11的絕對重均分子量為1.793×104g/mol，多分散系數為1.543，且其構型介于球形和隨機線團之間。通過原子力顯微鏡觀察SCPP11分子的形貌，結果表明SCPP

7、11分子間相互纏繞，呈規(guī)則團聚狀;經加熱處理后，SCPP11高度團聚狀結構大量減少，鏈延展開來。通過TEM觀察SCPP11的形貌，發(fā)現(xiàn)其呈團聚狀態(tài)，粒子的直徑在幾百納米不等。SCPP11粉未呈粗糙的小片狀聚集體，表面緊密，規(guī)整性不強，說明SCPP11固體為無定型結構。
　　 (2)采用CTX抑制小鼠模型，考察SCPP11對小鼠免疫的調節(jié)作用。結果表明，SCPP11對CTX造成的體重增長抑制有較好的改善作用，可不同程度提高胸腺指數

8、和脾臟指數，顯著提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力和血清溶血素水平，且對CTX致血清中免疫球蛋白水平、TNF-α和IL-2水平下降有不同程度的恢復作用。因此，SCPP11對可激活機體免疫，具有免疫調節(jié)功能。
　　 (3)采用Heps荷瘤小鼠模型，考察SCPP11對化療藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)的減毒作用和其體內抗肝癌活性。結果表明，與5-Fu組相比，SCPP11可對抗5-Fu所致的小鼠白細胞減少和免疫器官指數減小，且對5-

9、Fu所致的機體TNF-α和IL-2水平降低具有較好的恢復作用，此外SCPP11對5-Fu所致的肝損傷有一定的保護作用。可見，SCPP11對5-Fu具有較好的減毒作用;體內抗肝癌結果表明，在劑量為50mg/kg時，SCPP11可顯著抑制腫瘤的增長，腫瘤抑制率達到68.54％;SCPP11可顯著提高胸腺指數和小鼠血清中IL-2和TNF-α水平;且其對小鼠體重、肝臟指數、腎臟指數和心臟指數無顯著影響，可提高荷瘤小鼠外周血白細胞的數量，使荷瘤小

10、鼠血清AST水平恢復正常;同時提高小鼠肝臟的SOD活力，降低MDA水平?？梢?，SCPP11具有較好的抗腫瘤活性，且對機體無毒。SCPPI1主要通過調節(jié)機體免疫來抑制腫瘤的增長。(4)以腹腔巨噬細胞RAW264.7為研究對象，考察SCPP11對腹腔巨噬細胞的免疫調節(jié)和作用機制。MTT實驗結果表明，SCPP11濃度高達1mg/mL，SCPPI1對RAW264.7細胞沒有明顯的毒性作用;經SCPP11刺激的RAW264.7細胞和其上清液均可顯

11、著抑制HepG-2細胞的增殖;SCP11可顯著提高RAW264.7細胞中性紅吞噬活力和分泌NO，TNF-α和IL-1β的水平;通過westernblot法和RT-PCR法研究發(fā)現(xiàn)SCPP11可顯著上調iNO蛋白和mRNA的表達，上調TNF-αmRNA表達，進一步證實SCPP11直接影響蛋白質代謝和基因表達;TLR4/TLR-2/CR3抗體阻斷實驗結果表明，抗TLR4抗體可顯著阻斷SCPP11刺激RAW264.7細胞釋放NO和TNF-α的