Velcade（bortezomib）誘導K562細胞凋亡的基因表達譜研究.pdf

1、本課題首先從形態(tài)學方面觀察了Velcade處理后K562細胞的變化，然后進一步分析了K562細胞基因表達的改變。尋找差異基因的方法有很多種，如差異顯示技術、代表性差異分析、抑制性消減雜交、基因芯片等。其中基因芯片是近年來發(fā)展起來的一門新的基因分析技術，尤其是表達譜基因芯片，可對基因表達情況進行全面、快速、敏感、高效的分析，因此本課題選用表達譜基因芯片作為研究工具。我們采用光鏡、DNA片段化檢測等方法，觀測了Velcade處理后正常K56

2、2細胞的各種變化。提取兩組細胞的基因組DNA，1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。在光鏡下觀察Velcade處理后的K562細胞，發(fā)現細胞增殖被部分抑制，有的細胞體積變小、變形，細胞核濃縮，但細胞膜完整。DNA片段化檢測結果顯示Velcade處理組細胞DNA電泳條帶呈典型的梯狀條帶，表明細胞出現凋亡。研究發(fā)現Velcade可以有效地抑制K562增殖，使細胞增殖進程受阻，并可導致部分K562細胞凋亡。 運用基因芯片技術，檢測了Velcad

3、e處理后K562細胞的基因表達譜變化。首先提取對照組和Velcade處理組K562細胞的總RNA，采用Agilent BioAnalyzer2100進行RNA樣品的質量鑒定。采用Agilent低RNA熒光線性擴增試劑盒對樣品進行雙色熒光標記：總RNA逆轉錄合成cRNA，以Cy3標記對照組K562細胞，Cy5標記Velcade處理組K562細胞，合成熒光標記的cRNA，并對標記的cRNA進行純化。純化后的樣品和Agilent Human

4、1A60mer寡核苷酸基因芯片進行雜交，雜交完畢后依次用漂洗緩沖液進行芯片的漂洗。然后采用Agilent基因芯片掃描儀掃描，掃描后的數據采用Feature Extraction軟件進行數據采集及標準化處理。然后采用Panther數據庫對差異表達基因進行生物學功能分析。最后采用半定量RT-PCR對有進一步研究價值且表達改變顯著的基因Nras、Etv6進行驗證。在芯片22153個檢測點中，發(fā)現共同差異表達基因640個，其中29個基因表達上調

5、。KT-PCR結果表明與芯片雜交結果基本一致。Velcade處理后K562細胞基因表達譜的變化為：致癌基因表達下調?；虮磉_的總體變化趨勢是促進凋亡、抑制增殖。 綜上所述，本研究采用Velcade處理K562細胞，DNA片段化檢測等手段，觀測了K562細胞的變化。研究表明，Velcade可以抑制K562細胞增殖，并誘導部分K562細胞凋亡。研究進一步結合基因芯片技術，針對Velcade處理后K562細胞的基因表達譜進行研究，發(fā)現