短小芽孢桿菌堿性蛋白酶基因啟動子的功能研究.pdf

1、短小芽孢桿菌UN-31-C-42是一株產(chǎn)生具有脫毛功能的堿性蛋白酶的菌株。該菌株的堿性蛋白酶基因編碼區(qū)已被克隆，本研究通過TAIL--PCR(Thermalasymmetric interlaced PCR)擴增得到堿性蛋白酶基因編碼區(qū)上游的啟動子片段Papr，經(jīng)測序、序列拼接及比對分析等對Papr進行了鑒定。該啟動子片段長797bp，在片段的5’端存在一個開放閱讀框，可能為磷酸甘油酸變位酶基因的部分編碼區(qū)，故堿性蛋白酶基因啟動子的長度

2、為378 bp。通過對啟動子序列的分析，推測出了該啟動子的保守序列及轉(zhuǎn)錄起始位點。對啟動子的順序缺失研究證實基因起始密碼子上游160bp的DNA片段包含完整的啟動功能片段。 根據(jù)Papr序列設(shè)計引物，從短小芽孢桿菌UN-31-C-42基因組中擴增獲得了包含啟動子、信號肽、前肽、成熟肽及終止子的完整的堿性蛋白酶基因片段WAp。將WAp插入大腸桿菌一芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒載體pSUGV4中，構(gòu)建了堿性蛋白酶基因表達質(zhì)粒pSUBpWAp。

3、將pSUBpWAp分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109、枯草芽孢桿菌WB600以及短小芽孢桿菌UN-31-C-42中進行表達。包含了質(zhì)粒pSUBpWAp的大腸桿菌JM109細胞內(nèi)外均檢測不到堿性蛋白酶活性。在枯草芽孢桿菌WB600中的表達則可在胞外檢測到堿性蛋白酶活性，證明啟動子Papr可在枯草芽孢桿菌中啟動堿性蛋白酶基因的表達，產(chǎn)生的堿性蛋白酶活性最高達到466.5U/ml，與包含Bp53啟動子的堿性蛋白酶基因表達質(zhì)粒pSUBpAp比較，酶活提

4、高2倍。pSUBpWAp在短小芽孢桿菌UN-31-C-42中也能表達產(chǎn)生堿性蛋白酶活性，但宿主菌的蛋白酶產(chǎn)量并未提高。利用細菌的16s rDNA通用引物從短小芽孢桿菌UN-31-C-42基因組中擴增到16s rDNA片段，將該片段插入載體pMD18-T中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD16s。從載體pSUGV4中擴增到卡那霉素抗性基因片段，與堿性蛋白酶基因一同插入質(zhì)粒pMD16s的16s rDNA片段中，構(gòu)建整合型質(zhì)粒。擬將該質(zhì)粒整合至短小芽孢桿