H3N2亞型豬流感病毒進化分析及重組HA1蛋白間接ELISA診斷方法的建立.pdf

1、H3N2亞型豬流感病毒在全世界豬群中廣泛存在,不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失,而且對人類健康造成威脅.為了了解我國2004～2005年豬流感病毒流行情況,我們對中國某些省市豬群進行豬流感血清學和病原調查研究,從1238份豬鼻棉拭子和豬肺、氣管樣品中分離到5株H3N2亞型豬流感病毒. 通過比較發(fā)現分離的5株H3N2亞型豬流感病毒HA和NA基因同源性較高,都達到99﹪以上.對其中一株A/Swine/Guangdong/9/05(H

2、3N2)(縮寫SW/GD/9/05)的全基因進行克隆、測序,構建HA、PB2、NP部分基因片段的系統進化樹,從系統進化樹來看它屬于近期人流感病毒分支,通過對HAl編碼的氨基酸序列和參考毒株進行比較,得知其在某些氨基酸位點發(fā)生了突變. 將RT-PCR擴增得到的全長為1.76kb的HA基因克隆到pMD-18T載體上,篩選、鑒定陽性重組子pMD-HA,以此為模板擴增出HAl片段,去除編碼HA信號肽的核苷酸序列,然后亞克隆到原核表達載體

3、pET30a上,經雙酶切、PCR鑒定,篩選重組表達質粒pET-HA1,經序列分析進一步驗證HAl基因完整.將重組表達質粒pET-HAl轉化到表達菌BL21(DE3)中,經終濃度為lmmol/L的IPTG誘導,表達產物經SDS-PAGE分析,結果顯示H3N2亞型豬流感病毒HAl基因在原核表達系統中己表達,HAl蛋白表達量占細胞總蛋白的40﹪,分子量近似42KD.Western-blot檢測結果表明表達蛋白具有良好的抗原性. 利用表

4、達并純化后的重組蛋白作為抗原,建立檢測H3亞型豬流感病毒抗體的間接ELISA,為了優(yōu)化ELISA反應條件,我們用H3亞型豬流感病毒的標準陽性血清和標準陰性血清進行反應,最終確定了抗原的最適包被濃度為1.5μg/100μl,最適血清稀釋度為1:100,酶標HRP的最適工作濃度為l:1000.該檢測方法不與HlNl、H5Nl、H9N2亞型豬流感病毒及豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬病等豬病的陽性血清發(fā)生交叉反應.與HI作對比實驗,同時對來自