谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元突觸活動對mTOR信號通路的調(diào)節(jié).pdf

1、突觸活動依賴性的蛋白質(zhì)合成在突觸可塑性的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用。目前已有研究顯示哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantarget of rapamycin,mTOR)信號通路是海馬神經(jīng)元細(xì)胞樹突中活動依賴性的蛋白合成的主要調(diào)控路徑。因此為了更加深入的研究和探討突觸活動對mTOR通路的影響及具體的調(diào)控機制,本研究擬在體外培養(yǎng)原代小鼠皮層神經(jīng)元的基礎(chǔ)上觀察谷氨酸誘導(dǎo)的突觸活動對mTOR通路相關(guān)蛋白表達的影響。
　　 目的:

2、>　　 1.明確谷氨酸誘導(dǎo)的突觸活動對原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達的影響;
　　 2.觀察谷氨酸受體阻斷劑及mTOR信號通路的特異性抑制劑對谷氨酸誘導(dǎo)的蛋白表達變化的影響。
　　 方法:
　　 在體外原代培養(yǎng)的C57小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞基礎(chǔ)上,采用10mM谷氨酸鈉處理7～8天的神經(jīng)元1h以誘導(dǎo)突觸活動,應(yīng)用Western Blot法檢測mTOR通路相關(guān)蛋白p70S6K(Thr389)

3、、p-GSK3β(Ser9)、TSC2和4EBP2的變化。此外,通過采用阻斷劑、抑制劑分別預(yù)處理神經(jīng)元20min,再加入終濃度為10mmol/L的谷氨酸鈉繼續(xù)培養(yǎng)1h,檢測阻斷劑或抑制劑對谷氨酸調(diào)控作用的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.建立了新生小鼠皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)技術(shù),用24 h小時內(nèi)新生C57小鼠,分離出大腦皮層,培養(yǎng)7～8天,通過免疫熒光染色方法鑒定,獲得純度較高的皮層神經(jīng)元;
　　 2.發(fā)現(xiàn)用谷氨酸誘導(dǎo)

4、神經(jīng)元突觸活動可以上調(diào)mTOR信號通路,表現(xiàn)為谷氨酸可以促進p70S6K(Thr389)的磷酸化,抑制p-GSK313(ser9)、TSC2和4E-BP2的表達,且上述蛋白表達的變化具有明顯的時間和濃度依賴性。此外,用mTOR的特異性抑制劑Rapa處理細(xì)胞能夠明顯的阻斷谷氨酸誘導(dǎo)的p-p70S6K磷酸化的增加;
　　 3.NMDA受體阻斷劑D-APV能逆轉(zhuǎn)谷氨酸誘導(dǎo)的mTOR的上調(diào)(*P＜0.05,**P＜0.01 vs.con

5、trol;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs.MSG),而AMPA受體阻斷劑CNQX無此作用;
　　 4.LiCI抑制GSK3β的活性后能夠活化mTOR通路,表現(xiàn)在LiC1可劑量依賴性的增加p70S6K(Thr389)的磷酸化,同時,LiC1處理能降低4E-BP2的表達。用mTOR特異性抑制劑Rapa處理細(xì)胞后阻斷了LiC1誘導(dǎo)的p-p70S6K(Thr389)的增加(**P＜0.01 vs control),但Rapa對于

6、LiCl誘導(dǎo)的4E-BP2的減少無明顯影響。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實驗建立的新生小鼠大腦皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法,可得到純度較高且生物學(xué)性狀穩(wěn)定的神經(jīng)元,為揭示神經(jīng)元生理、生化和病理等方面的復(fù)雜變化提供便利;
　　 2.在神經(jīng)元細(xì)胞中,谷氨酸誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元突觸的活動可以上調(diào)mTOR/p706SK信號通路,主要表現(xiàn)在促進p706SK(Thr389)的磷酸化,抑制TSC2和4E-BP2的表達,且Rapa可以阻斷谷氨