烏骨藤提取物抑制新生血管生成的機制研究.pdf

1、目的：烏骨藤提取物能抑制腫瘤血管生成，但其機制不明確。本研究通過觀察烏骨藤提取物(Marsdenia tenacissima extract，MTE)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HumanUmbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)增殖、遷移、凋亡及新生血管生成的影響探討其作用機制。
　　方法：對HUVEC進行培養(yǎng)，采用MTS法檢測MTE對細胞增殖的作用;采用劃痕實驗觀察細胞遷移的變化;采用Hoechst

2、/PI熒光染色法及流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡及周期;采用ATP、葡萄糖檢測試劑盒觀察細胞代謝產(chǎn)物變化;采用qRT-PCR檢測HUVEC相關(guān)基因的表達及采用雞胚(Chick ChorioallantoicMembrane，CAM)實驗觀察新生血管的生成。
　　結(jié)果：MTE對HUVEC增殖的抑制作用顯著，且隨濃度的升高其對細胞的抑制率逐步增強（**P＜0.01），抑制作用呈劑量依賴效應(yīng)。體外細胞劃痕實驗顯示，MTE處理組的遷移能力明顯低

3、于對照組，進一步驗證發(fā)現(xiàn)MTE能夠抑制HUVEC的遷移運動。Hoechst/PI熒光染色法顯示:MTE濃度達到160μg/mL時，細胞核被Hoechst染成亮藍色，PI復(fù)染呈特征性的細胞凋亡形態(tài);流式細胞儀檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，MTE能促進HUVEC的早期凋亡，將細胞周期阻滯在S期。不同濃度 MTE處理24h后，觀察ATP代謝及葡萄糖消耗情況，證實MTE處理后ATP/ADP代謝及葡萄糖消耗水平呈下降趨勢，具有顯著性差異（*P＜0.05），表

4、明MTE能夠通過抑制HUVEC代謝導(dǎo)致細胞增殖減少。半定量RT-PCR檢測MTE作用于HUVEC后相關(guān)基因的表達，顯示MTE能上調(diào)Caspase-3，PICK1和ICA69，LC3-Ⅱ，Beclin-1和PTEN基因的mRNA表達水平，下調(diào)Bcl-2，VEGFR，P2Y6R，CCL-2,AKT和mTOR基因的mRNA表達，表明MTE能夠影響HUVEC細胞中數(shù)個凋亡和遷移相關(guān)基因的表達。通過qRT-PCR相對定量檢測mRNA顯示:MTE處