大鼠再生肝細(xì)胞的分離鑒定和VEGF、HSP70的表達(dá)分析.pdf

1、目的：建立再生肝中各種細(xì)胞的分離鑒定方法；在組織和細(xì)胞水平上，研究大鼠肝再生過程中VEGF和HSP70的表達(dá)變化，并探討VEGF和HSP70在肝再生過程中的作用。方法：300只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組。切除實(shí)驗(yàn)組大鼠2/3肝，分別于術(shù)后恢復(fù)2h、4h、8h、12h、16h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h取肝組織或原位灌注分離細(xì)胞。用免疫組織化學(xué)和Western-blot技術(shù)檢測肝組織和分離的肝

2、實(shí)質(zhì)細(xì)胞中VEGF和HSP70的表達(dá)變化，并做圖像分析。結(jié)果：(1)本實(shí)驗(yàn)總結(jié)出一套簡單易行的肝臟中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞的分離鑒定方法。(2)免疫組化結(jié)果顯示，VEGF主要由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌；在正常肝臟中很少表達(dá)，大部分肝切除后24h肝內(nèi)VEGF表達(dá)開始增加，72h達(dá)到高峰，144h后恢復(fù)正常(P＜0.01)。肝組織Western-blot檢測結(jié)果表明，大鼠肝部分切除后24hVEGF的表達(dá)量開始增加，

3、48h-72hVEGF的表達(dá)量達(dá)到高峰，然后逐漸下降恢復(fù)到正常水平；所分離的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞勻漿液中VEGF的表達(dá)量與肝組織勻漿液相比有一定的減少，尤其是PH36h到96h。(3)Western-blot結(jié)果與正常對照組相比，再生肝組織內(nèi)PCNA的表達(dá)量分別在16h、36h、96h出現(xiàn)三個表達(dá)高峰，120h后開始下降，至144h后基本恢復(fù)到正常水平；分離恢復(fù)不同時期的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與肝組織表達(dá)規(guī)律基本相同。免疫組化結(jié)果顯示肝大部分切除后，在36h

4、到48h之間有很大一部分肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為PCNA陽性，72h時肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞開始呈現(xiàn)PCNA陽性。(4)Western-blot檢測結(jié)果表明正常肝組織中HSP70低水平表達(dá)，PH后2h內(nèi)HSP70的表達(dá)量有明顯的上升，12-24h表達(dá)水平較高，在96h表達(dá)量最多，以后又逐漸恢復(fù)到正常水平；而分離的不同恢復(fù)時期的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞勻漿液中PH2h、48h、96hHSP70分別出現(xiàn)表達(dá)高峰，接著慢慢回落。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)總結(jié)的細(xì)胞分離和鑒定方法具有簡單