榆黃茹凝集素的分離純化及部分性質(zhì)研究.pdf

1、榆黃菇子實(shí)體經(jīng)勻漿、抽提、離心、CM-Sepharose、Q-Sepharose、SP-Sepharose離子交換及Scphacryl S-200分子篩層析，得到純化的榆黃菇凝集素(Pleurotus citrinopileatus lecfm，PCL)。SDS-PAGE和SephacrylS-200凝膠過(guò)濾分析表明榆黃菇凝集素是分子量約為17.5 kDa的單體蛋白。凝血活性結(jié)果表明榆黃菇凝集素能凝集天然的兔血細(xì)胞和人四種血型細(xì)胞，沒(méi)有

2、表現(xiàn)出血型專一性。凝血抑制活性結(jié)果表明測(cè)試的糖和糖蛋白中，僅唾液酸和卵粘蛋白能有效抑制凝集素的凝血活性，最低抑制濃度分別為0.39 mM和1.25μg/ml。PCL的凝血活性在50℃以下保持相對(duì)的穩(wěn)定性，高于50℃，凝血活性逐步傷失，高于70℃，凝血活性全部丟失。測(cè)試的pH范圍內(nèi)，PCL凝血活性在pH 4.0-12.0保持穩(wěn)定，當(dāng)pH低于4.0或高于12.0時(shí)，部分或大部分的凝血活性丟失。EDTA處理和所有測(cè)試的二價(jià)或三價(jià)金屬離子不影響

3、榆皇菇凝集素的凝血活性，表明凝血活性不依賴測(cè)試的金屬離子。脲、鹽酸胍、SDS對(duì)凝集素凝血活性的影響表明，隨著變性劑濃度的升高，凝血活性逐漸傷失。氨基酸殘基的化學(xué)修飾結(jié)果表明：在非變性或變性條件下，色氨酸殘基的修飾均導(dǎo)致凝血活性完全喪失，分別有5.6和5.8個(gè)色氨酸殘基被修飾，表明色氨酸參與凝集素凝血活性中心的組成；當(dāng)存在唾液酸的條件下，分別有2.8和3個(gè)色氨酸殘基被修飾，預(yù)示著大約三個(gè)色氨酸殘基直接參與糖結(jié)合活性的組成。賴氨酸殘基修飾導(dǎo)

4、致80％凝血活性丟失；修飾前加入唾液酸，活性得到較好的保持，分別由7.6和4.8個(gè)賴氨酸殘基被修飾，預(yù)示著大約三個(gè)賴氨酸殘基參與糖結(jié)合活性組成。蛋氨酸殘基的修飾導(dǎo)致60％凝血活性的傷失；修飾前加入1mM的唾液酸，凝血活性保持完整，表明蛋氨酸殘基可能位于凝血活性中心附近位置并對(duì)凝血活性中心起一定的作用；酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸、組氨酸、巰基、羧基組和精氨酸殘基的修飾沒(méi)有影響凝血活性，表明這些殘基不位于糖結(jié)合活性位點(diǎn)或凝血活性中心。天然態(tài)凝集

5、素在280 nm和295 nm激發(fā)時(shí)，熒光光譜的最大發(fā)射峰在335 nm處，說(shuō)明凝集素分子中的色氨酸殘基周圍的極性較弱，位于相對(duì)疏水區(qū)。溫度對(duì)熒光光譜的影響表明，除40℃熒光強(qiáng)度略為升高外，隨著溫度的升高熒光強(qiáng)度逐漸降低，溫度到60℃后熒光強(qiáng)度顯著降低，同時(shí)凝血活性降低60％，表明溫度的升高逐漸破壞維持凝血活性中心的構(gòu)象，直至凝血活性完全傷失。pH對(duì)熒光光譜的影響表明，中性pH值不影響凝集素的熒光光譜；pH為4或10時(shí)，熒光強(qiáng)度降低，最

6、大發(fā)射波長(zhǎng)和光譜形狀沒(méi)有變化，而凝血活性沒(méi)有變化，表明凝集素的凝血活性中心對(duì)分子構(gòu)象的變化具有一定的耐受性；pH為2或12時(shí)，熒光強(qiáng)度均顯著降低，pH為2.0時(shí)凝血活性全部丟失，表明凝血活性中心遭到徹底破壞，導(dǎo)致凝血活性傷失；而pH為12.0是活性保持不變，表明凝血活性中心對(duì)堿性環(huán)境有較強(qiáng)的耐受性。各種修飾在不同程度上影響了熒光光譜，結(jié)果表明色氨酸、賴氨酸和蛋氨酸在分子中起著重要作用；而酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸、組氨酸、巰基、羧基組和精氨

7、酸殘基的修飾在維持凝血活性中心或分子構(gòu)象中起著一定的作用。熒光淬滅研究表明丙烯酰胺和碘乙酸分別能淬滅榆黃菇凝集素中色氨酸殘基94.3％和97.1％的熒光，而KI幾乎不能淬滅PCL的熒光，表明幾乎所有的色氨酸位于凝集素近分子表面相對(duì)疏水的淺溝或強(qiáng)陰離子區(qū)域。在本文的研究中，榆皇菇凝集素表現(xiàn)出對(duì)小麥枯萎病菌和水稻稻瘟病菌的抑制作用，最低的抑制濃度分別為37.5μg/ml和25μg/ml，而榆皇菇凝集素在濃度為0.3mg/ml時(shí)不影響棉花枯萎