銀、銅離子對人角質(zhì)形成細胞增殖的影響及機制探索.pdf

1、典型的傷口愈合過程包括炎癥期、血管生成和肉芽組織形成期、再上皮化和結(jié)締組織重構(gòu)等階段，其中角質(zhì)形成細胞的增殖及上皮化是傷口封閉的中心環(huán)節(jié)。圍繞促進角質(zhì)形成細胞增殖這一關(guān)鍵點，衍生出了各式各樣的局部治療技術(shù)及藥物。銀、銅、鋅等金屬制劑及敷料長期以來在燒傷創(chuàng)面的局部治療中發(fā)揮著重要作用。為深入探究它們的細胞生物學(xué)效應(yīng)，我們以硝酸銀、硝酸銅對人角質(zhì)形成細胞增殖的影響為例，開展了相關(guān)的研究工作。
　　大量的體外實驗證實Ag+及Cu2+在≥

2、1×10-4 M濃度下均存在不同程度的細胞增殖毒性，體內(nèi)實驗也報道了高濃度含銀制劑及敷料對創(chuàng)面愈合的負面影響。然而，在亞細胞毒濃度下，Ag+、Cu2+對細胞雖無增殖毒性，但細胞內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生卻明顯增加。這部分增加的細胞內(nèi)活性氧所產(chǎn)生的細胞生物學(xué)效應(yīng)尚不明確。眾所周知，ROS除了參與細胞凋亡、壞死，還可作為重要的信號分子，參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄因子激活，從而影響基因的表達，促進細胞的增殖和分化。據(jù)此，我們通過前期的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，亞細

3、胞毒濃度的Ag+、Cu2+能夠在特定的濃度范圍內(nèi)既促進角質(zhì)形成細胞增殖，又同時誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。
　　綜上所述，我們假設(shè)不同濃度的Ag+、Cu2+對誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細胞ROS產(chǎn)生具有不同的影響，這也進一步向下游傳導(dǎo)影響人角質(zhì)形成細胞的增殖活性，且Ag+、Cu2+在ROS產(chǎn)生的雙向性劑量-效應(yīng)關(guān)系上相互契合。本研究以不同濃度Ag+、Cu2+對人永生化角質(zhì)形成細胞系（HaCaT細胞）增殖功能的影響為觀察重點，運用活性氧清除劑NAC

4、尋找并驗證其與細胞內(nèi)ROS生成上調(diào)的相互關(guān)系。同時，運用iTRAQ技術(shù)尋找組間差異蛋白，進一步通過生物信息學(xué)分析其功能富集情況，預(yù)期初步明確Ag+、Cu2+作用下角質(zhì)形成細胞增殖相關(guān)的潛在分子靶點。
　　1.研究目的：
　　本研究擬觀察不同濃度Ag+、Cu2+對人角質(zhì)形成細胞增殖功能影響，檢測其誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生能力，采用活性氧清除劑驗證ROS在亞細胞毒濃度Ag+、Cu2+促增殖效應(yīng)中扮演的角色，利用高通量的iTRAQ技術(shù)

5、篩選差異蛋白并做功能注釋和富集分析，尋找細胞增殖及ROS生成相關(guān)的潛在分子靶點，為進一步研究Ag+、Cu2+影響角質(zhì)形成細胞增殖功能的作用機制提供實驗依據(jù)。
　　2.研究方法
　　2.1 Ag+對人角質(zhì)形成細胞增殖功能及細胞內(nèi)ROS生成的影響
　　2.1.1 采用CCK-8法檢測不同濃度Ag+和（或）活性氧清除劑(NAC)對人角質(zhì)形成細胞增殖功能的影響，鑒別Ag+的細胞毒性濃度與亞細胞毒濃度;對特定的亞細胞濃度進行Br

6、dU摻入、PCNA表達、細胞周期等實驗檢測，以驗證細胞增殖活性改變。
　　2.1.2 通過DCFH-DA熒光分析檢測不同濃度Ag+和（或）NAC對人角質(zhì)形成細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平的影響。
　　2.1.3 應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)定量技術(shù)篩選亞細胞毒濃度Ag+作用下人角質(zhì)形成細胞的差異蛋白，并對所有差異蛋白質(zhì)做功能注釋和富集分析。
　　2.2 Cu2+對人角質(zhì)形成細胞增殖及小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響
　　2.2.1

7、采用CCK-8法檢測不同濃度Cu2+和（或）NAC對人角質(zhì)形成細胞增殖功能的影響。
　　2.2.2 通過DCFH-DA熒光分析檢測不同濃度Cu2+和（或）NAC對人角質(zhì)形成細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平的影響。
　　2.2.3 應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)定量技術(shù)篩選亞細胞毒濃度Cu2+作用下人角質(zhì)形成細胞的差異蛋白，并對所有差異蛋白質(zhì)做功能注釋和富集分析。
　　2.2.4 采用雄性BALB/c小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型評價不同濃度Cu2

8、+對創(chuàng)面愈合的影響。
　　3.研究結(jié)果：
　　3.1 Ag+對人角質(zhì)形成細胞增殖功能及細胞內(nèi)ROS生成的影響
　　3.1.1 10-6M、10-5M Ag+在24 h、48 h和72 h均能明顯促進HaCaT細胞增殖，細胞相對增殖率約103.18％～118.76％(P值均＜0.05)，在24 h～120 h的各個時相點上，10-8M、10-7 M Ag+對HaCaT細胞增殖無明顯影響，細胞相對增增殖率約99.24％～1

9、04.65％(P值均＞0.05)，而10-4 M Ag+造成細胞在短時間內(nèi)完全死亡，OD值波動在0.263～0.283，接近于空白值;10-6M、10-5M Ag+作用HaCaT細胞48 h后BrdU陽性細胞數(shù)增加，PCNA免疫熒光增強，10-5M Ag+還顯著升高細胞的增殖指數(shù)(PI)。
　　3.1.2 10-6M、10-5M Ag+處理HaCaT細胞后，在5 min～60 min時間點上細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生顯著增強;加入5 mM

10、NAC共培養(yǎng)后，細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯減少;加入5mMNAC共培養(yǎng)后，10-6M、10-5M Ag+的促增殖效應(yīng)消失。
　　3.1.3 在10-6～10-4 M范圍內(nèi)進一步細分篩選發(fā)現(xiàn)7.5×10-6 M濃度下Ag+具有最佳的促增殖作用;對0M、1×10-7M、7.5×10-6M濃度Ag+處理48 h的HaCaT細胞樣品進行iTRAQ蛋白定量，通過對組間差異蛋白進行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):7.5×10-6 MAg+組和1×10-7M A

11、g+組除在多樣化微生物代謝、氨?；鵷RNA合成等通路富集外，在核糖體通路的差異蛋白富集率達15.15％(40/264)、16.58％(33/199)，且全部為上調(diào);在糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑、次生代謝物生物合成、乙醛酸和二元羧酸等眾多碳水化合物代謝相關(guān)的通路均有顯著富集。此外，7.5×10-6M Ag+組在RNA轉(zhuǎn)運、細胞外基質(zhì)受體相互作用及半胱氨酸和蛋氨酸代謝等通路上具有自身獨特的富集表現(xiàn)。
　　3.2 Cu2+

12、對人角質(zhì)形成細胞增殖及小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響
　　3.2.1 與陰性對照(0 M Cu2+)相比，10-6、10-5M Cu2+處理48 h后HaCaT細胞相對增殖率分別顯著升高至116.19％(P=0.027)、113.37％(P=0.036)，5 mM NAC能拮抗其促增殖作用。10-4 M Cu2+組表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，相對增殖率下降至12.20％(P=0.001);進一步上升至10-3 M時，細胞在短時間內(nèi)幾乎完

13、全死亡，OD值僅為（0.05±0.21，P＜0.01），基本接近于空白值。
　　3.2.2 與陰性對照(0 M Cu2+)相比，10-6、10-5、10-4 M組Cu2+處理HaCaT細胞30 min后其細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生達到127.47％（P=0.001）、124.28％(P=0.031)、125.60％(P=0.004)，60 min后進一步上升至140.47％(P=0.002)、134.29％(P=0.007)、130.66％

14、(P=0.007);10-8、10-7 M Cu2+在處理后60 min也刺激HaCaT細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯升高至110.99％（P=0.016）及117.34％(P=0.016);加入5 mM NAC共培養(yǎng)后，細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯減少。
　　3.2.3 對0M、1×10-7 M、1×10-6 M濃度Cu2+處理48 h的HaCaT細胞樣品進行iTRAQ蛋白定量，通過對組間差異蛋白進行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):1×10-7 M Cu2+

15、組和1×10-6M Cu2+組在糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑、丙酮酸代謝、脂肪酸代謝等通路顯著富集，其中在核糖體通路的差異蛋白富集率達12.07％和26.24％，且全部為上調(diào);此外，1×10-6 M Cu2+組在谷胱甘肽代謝及半胱氨酸、蛋氨酸代謝途徑上，差異蛋白上調(diào)率高達88.89％(8/9)，但兩條通路上富集的差異蛋白數(shù)合計僅占總差異蛋白數(shù)的2.36％(9/381)。
　　3.2.4 與陰性對照(0 M Cu2+)相

16、比，10-6M Cu2+水凝膠敷料在第6、8、10d能夠顯著提高小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合率;10-8M Cu2+組在第8、10d創(chuàng)面愈合率也顯著升高;10-4M Cu2+組的創(chuàng)面愈合率在第2～12 d各個時相點上與對照組無明顯差異，但其在第8、10d與10-6M Cu2+組之間存在明顯差異。
　　4.結(jié)論：
　　4.1 ≥1×10-4M的Ag+、Cu2+對HaCaT細胞均存在不同程度的細胞毒性。
　　4.210-6～1

17、0-5 M的Ag+、Cu2+均能在作用48 h后促進HaCaT細胞增殖，濃度為7.5×10-6M Ag+，1×10-6M Cu2+具有最佳的促增殖作用。
　　4.3 在亞細胞濃度范圍內(nèi)，細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生隨Ag+、Cu2+濃度增加而增加;活性氧清除劑NAC能夠降低細胞內(nèi)ROS水平，同時拮抗亞細胞毒濃度Ag+、Cu2+的促增殖效應(yīng)，且ROS變化水平與細胞相對增殖率呈正相關(guān)。
　　4.4 蛋白組學(xué)分析顯示:(1)亞細胞毒濃度Ag+

18、處理后可能引起HaCaT細胞碳水化合物代謝及蛋白質(zhì)合成增加，可能經(jīng)生物氧化過程增加ATP和ROS生成，進一步由ROS激活下游的ERK1/2、JNK等通路，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達，促進細胞增殖;(2)亞細胞毒濃度Cu2+處理HaCaT細胞后，在糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑、丙酮酸代謝、脂肪酸代謝等眾多能量代謝相關(guān)的通路均有顯著富集，在核糖體通路的差異蛋白富集率更達到12.07％和26.24％，且全部為上調(diào)，可能伴隨蛋白質(zhì)翻譯合成的