TET2對(duì)apoE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、TET2蛋白(ten-eleven-translocation2)是一種DNA甲基化修飾酶，它是在進(jìn)化上高度保守的TET(ten-eleven-translocation)家族成員之一，通過(guò)將5mC氧化為5hmC而發(fā)揮作用。研究在動(dòng)脈斑塊發(fā)生初期， DNA甲基化譜異常，表明斑塊中自噬異常。本課題組前期研究表明,高脂飲食 apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變中自噬障礙、TET2表達(dá)水平下調(diào)，推測(cè) TET2可能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬途徑從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥

2、樣硬化作用。為證實(shí)該假說(shuō)，本研究首先采用apoE-/-小鼠動(dòng)物模型結(jié)合慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，觀察TET2過(guò)表達(dá)對(duì)apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變以及自噬的影響；在此基礎(chǔ)上，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法觀察TET2對(duì)HUVECs（Human umbilical vein endothelial cells）自噬及其潛在的分子機(jī)制。
　　目的:探索TET2對(duì)apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變的影響及其可能潛在分子機(jī)制。
　　方法:8周齡的雄性

3、apoE-/-小鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組、過(guò)表達(dá)TET2組，每組20只，分別尾靜脈注射生理鹽水及過(guò)表達(dá)TET2慢病毒，每六周注射一次，每只小鼠慢病毒注射量為4×107TU/次，兩組小鼠均高脂飲食，自由飲水，喂養(yǎng)12周后，將小鼠處死。全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定兩組血脂水平，蘇丹Ⅳ染色法及體視顯微鏡下觀察主動(dòng)脈脂質(zhì)蓄積情況，HE染色法觀察主動(dòng)脈根部病理形態(tài)改變，油紅O染色法檢測(cè)主動(dòng)脈竇部動(dòng)脈粥樣硬化病變處脂質(zhì)蓄積的情況，免

4、疫熒光法檢測(cè)主動(dòng)脈根部TET2和自噬標(biāo)志物Beclin1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）和自噬障礙標(biāo)記物p62表達(dá)情況，及主動(dòng)脈根部甲基化水平改變情況。培養(yǎng) HUVECs，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使細(xì)胞過(guò)表達(dá)或沉默TET2后，50μg/mL oxLDL處理細(xì)胞24小時(shí)，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法觀察細(xì)胞TET2蛋白、5hmC、5mC含量變化情況；Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中TET2蛋白、自噬標(biāo)記物Beclin1、LC3、P62蛋白的表達(dá)；以m

5、RFP-GFP-LC3腺病毒感染細(xì)胞36h，觀察其自噬流變化；亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法檢測(cè)自噬相關(guān)基因Beclin1啟動(dòng)子甲基化改變情況。
　　結(jié)果:過(guò)表達(dá) TET2組的血脂水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯改變，但主動(dòng)脈粥樣硬化病變面積明顯減少； HE結(jié)果表明與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)TET2組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化程度降低，油紅O染色分析結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)TET2可以減少apoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脂質(zhì)蓄積；免疫熒光及Western blo

6、t結(jié)果表明動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中5hmC含量及自噬標(biāo)記物 Beclin1、LC3Ⅱ含量明顯增加，p62的表達(dá)水平降低。過(guò)表達(dá)TET2能夠使細(xì)胞TET2、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)上調(diào)，5hmC含量增加，5mC含量減少，P62蛋白表達(dá)下調(diào)；而TET2低表達(dá)能夠使Beclin1、LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)下調(diào)，P62蛋白表達(dá)上調(diào)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-LC3腺病毒后，過(guò)表達(dá)TET2組細(xì)胞出現(xiàn)明顯增強(qiáng)的自噬流；甲基化檢測(cè)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)TET2