舒巴坦通過激活星形膠質細胞p38 MAPK通路上調GLT-1的表達發(fā)揮抗氧葡萄糖剝奪引起的海馬神經元死亡的作用.pdf

1、谷氨酸是中樞神經系統(tǒng)一種重要的興奮性神經遞質，對維持正常腦功能至關重要，但突觸間隙過高濃度的谷氨酸同時具有很強的神經毒性。腦缺血和再灌注后，谷氨酸的過度釋放或谷氨酸轉運蛋白對谷氨酸清除不足可導致谷氨酸在突觸間隙中堆積，突觸間隙過量的谷氨酸作用于神經元突觸后膜的離子型和代謝型谷氨酸受體，可引發(fā)興奮性毒性，例如鈣超載，鈉超載，自由基產生和凋亡等。腦內細胞外沒有代謝谷氨酸的酶，腦內細胞外谷氨酸的清除主要依靠高親和力興奮性氨基酸轉運體系統(tǒng)(ex

2、citatory amino acid transporters，EAATs)來維持。膠質細胞谷氨酸轉運體-1(glial glutamate transporter-1，GLT-1)在清除細胞外谷氨酸中的作用最為重要。多種證據表明，腦缺血預處理或藥物可以通過上調 GLT-1的表達及增強GLT-1對谷氨酸的攝取活性，對神經元的缺血損傷發(fā)揮保護作用。
　　Rothstein等報道，在體實驗中，β-內酰胺抗生素如頭孢曲松可選擇性地促進

3、GLT-1在腦內的表達。體外實驗中，頭孢曲松可顯著激活人胎兒星形膠質細胞或COS7細胞系中的GLT-1啟動子，進而促進GLT-1的上調。但大量使用β-內酰胺抗生素，會帶來例如菌群失調和細菌耐藥性等多種副作用。舒巴坦是一種非典型的β-內酰胺抗生素，抗菌能力很弱，臨床上常作為其它β-內酰胺類抗生素的增效劑。我室最近的研究表明，在大鼠全腦缺血模型中，舒巴坦預防性給藥，可以通過上調海馬CA1區(qū)GLT-1的表達減輕錐體神經元的缺血性損傷。這些發(fā)現

4、為應用舒巴斯坦預防和治療腦缺血損傷的臨床研究提供了有益的基礎和參考。然而，在體實驗很難證明舒巴坦對星形膠質細胞GLT-1表達的直接作用，因此有必要利用星形膠質細胞培養(yǎng)技術，體外研究舒巴坦對星形膠質細胞GLT-1表達的直接作用。此外，進一步研究舒巴坦上調GLT-1的信號轉導通路，可更好地理解舒巴坦在腦內的作用，促進舒巴坦作為抗腦缺血藥物的臨床開發(fā)和應用研究。
　　p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated

5、proteinkinases，p38 MAPK)是一種重要的細胞內信號轉導系統(tǒng)，參與一系列生理和病理過程，包括細胞死亡和存活。p38 MAPK的激活如一把雙刃劍，p38 MAPK的過度激活可促進腦缺血后的神經元死亡，但也有充分證據表明p38 MAPK的適度激活對缺血組織器官的保護作用。我室最新研究表明，全腦缺血預處理可誘導大鼠海馬CA1區(qū)p38 MAPK適度激活，同時p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580或反義寡核苷酸可抑制全腦

6、缺血預處理誘導的大鼠腦缺血耐受和海馬CA1區(qū)GLT-1上調。這些研究結果表明，p38 MAPK的適度激活可能介導GLT-1表達的上調，并誘導腦缺血耐受。
　　因此，本實驗旨在研究 p38 MAPK信號通路在舒巴坦誘導的海馬星形膠質細胞GLT-1表達上調和抗氧葡萄糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）模擬缺血損傷過程中的作用。
　　第一部分：舒巴坦發(fā)揮抗氧葡萄糖剝奪引起的海馬神經元死亡和上調海馬

7、星形膠質細胞GLT-1表達的作用
　　目的：
　　應用神經元星形膠質細胞共培養(yǎng)技術，觀察舒巴坦對OGD引起的海馬神經元死亡的影響，探討舒巴坦的抗OGD引起的神經元損傷作用。應用單純星形膠質細胞培養(yǎng)技術，通過觀察在OGD狀態(tài)下，舒巴坦預孵育對星形膠質細胞GLT-1表達的影響，證明星形膠質細胞GLT-1表達上調在舒巴坦抗OGD中的作用。
　　方法：
　　為觀察舒巴坦對OGD引起的海馬神經元死亡的影響，取24 h內新生

8、鼠海馬行神經元星型膠質共培養(yǎng)10天后，細胞隨機分為4組；為觀察舒巴坦預孵育對OGD后星形膠質細胞GLT-1表達的影響，取1-2天新生鼠海馬行單純星形膠質細胞培養(yǎng)，并將細胞傳至3-4代，最后一代細胞長滿瓶底后，將細胞隨機分為3組（4組中的前3組），4組如下：
　　(1)對照組：正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48 h+2 h+24 h，以上時間段分別對應下面實驗分組中實驗處理的時間段，48 h對應舒巴坦孵育的時間段，2 h對應OGD的時間段，24

9、 h對應OGD復氧后至收集細胞的時間段。
　　(2)OGD組：首先細胞正常培養(yǎng)48 h后（對應下一組舒巴坦孵育時間段），進行2 h的OGD后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。
　　(3)舒巴坦+OGD組：共培養(yǎng)細胞用加入舒巴坦培養(yǎng)液中孵育48 h，之后行OGD，方法同OGD組。同時設溶劑對照組，用NS代替舒巴坦。根據舒巴坦的劑量，進一步分為5μM,25μM和125μM3個亞組，以觀察其量效關系。
　　(4)舒巴坦對照

10、組：這一實驗組只用于共培養(yǎng)中，觀察細胞存活情況。培養(yǎng)基中加入舒巴坦生理鹽溶液（100×），在舒巴坦終濃度為125μM下孵育48小時，換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h+24 h。
　　共培養(yǎng)的實驗各組于OGD復氧后24 h或相應時間點收集細胞，赫克斯特/碘化丙啶(hoechst/propidium iodide, HO/PI)染色法觀察計數神經元死亡百分率，MTT法觀察細胞活力，分析舒巴坦對OGD所致的海馬神經元死亡及損傷的影響。單純星

11、形膠質細胞培養(yǎng)的實驗各組于OGD復氧后12 h和24 h兩個時間點或相應時間點收集星形膠質細胞，應用免疫細胞化學和western blot兩種方法觀察舒巴坦對OGD后星形膠質細胞GLT-1表達的影響。
　　結果：
　　1.HO/PI染色顯示，對照組死亡細胞百分比是9.2±0.5％。2 h OGD可以使死亡細胞的百分比增加到71.6±2.4%，與對照組相比，死亡細胞的百分比明顯提高；而且明場照片與 HO/PI染色熒光圖片合成后

12、可以看出，死亡細胞主要為神經元，說明2 h的OGD可以使神經元的死亡百分率明顯提高。舒巴坦預孵育可以劑量依賴地降低海馬神經元的死亡率，125μM的舒巴坦具有最好的藥效，125μM的舒巴坦預孵育可以將死亡細胞的百分比降低至15.6±1.0%。NS溶劑對照組與OGD組相比，死亡細胞的百分比無明顯差異，說明溶劑不能改變OGD引起的海馬神經元死亡。以上結果共同說明，2 h的OGD可以明顯增加神經元的死亡，而舒巴坦有效的阻止了OGD引起的海馬神經

13、元死亡，此效應呈現良好的劑量依賴性。與對照組相比，舒坦坦對照組中，正常共培養(yǎng)中加入最大濃度125μM的舒巴坦并未引起死亡細胞的百分比的改變，說明最大濃度125μM的舒巴坦無明顯損傷作用。
　　2.MTT檢測結果顯示：與正常對照組相比，2 h的OGD可顯著降低共培養(yǎng)的細胞活力；而48 h的舒巴坦預孵育可以劑量依賴地增加共培養(yǎng)的細胞活力，并呈現明顯的劑量依賴性。舒巴坦對照組的細胞活力與正常對照組相比無明顯差異，說明最大濃度125μM的

14、舒巴坦無明顯損傷作用。
　　以上結果表明，舒巴坦可劑量依賴的對抗氧葡萄糖剝奪引起海馬神經元死亡和損傷。
　　3.免疫細胞化學結果顯示：在對照組，GLT-1廣泛表達于星形膠質細胞。與對照組相比，OGD組的GLT-1表達明顯下調，約為正常組的1/2-2/3。與OGD組相比，舒巴坦預孵育可以顯著上調OGD處理后的星形膠質細胞GLT-1的表達，這種上調呈明顯的劑量依賴性，最大劑量125μM舒巴坦可使其表達增加至對照組的1.5-2倍，

15、OGD組的2-3倍，并且這種上調可持續(xù)到OGD后24 h，這一時間覆蓋了OGD后神經元死亡的時間，有利于其發(fā)揮神經元保護作用。與OGD組相比，舒巴坦的溶劑對照組GLT-1的表達無明顯變化。
　　4.Western blot結果顯示：對照組GLT-1有一定的基礎表達。與對照組相比，OGD組的GLT-1表達明顯下調。與OGD組相比，舒巴坦+OGD組 GLT-1的表達明顯上調，呈劑量依賴性，且表達上調時間可持續(xù)到到OGD復氧后24 h。

16、與OGD組相比，舒巴坦的溶劑對照組GLT-1的表達無明顯變化。
　　小結：
　　舒巴坦可劑量依賴的引起星形膠質細胞的GLT-1表達的持續(xù)上調，這種上調可能是共培養(yǎng)中舒巴坦對抗OGD引起神經元死亡的機制之一。
　　第二部分 舒巴坦序列上調星形膠質細胞p-p38 MAPK和GLT-1的表達
　　目的：
　　1.觀察舒巴坦對正常星形膠質細胞 GLT-1、p-p38 MAPK和總 p38 MAPK表達的影響。

17、>　　2.比較舒巴坦上調正常星形膠質細胞GLT-1和p-p38 MAPK蛋白表達的時間進程。
　　方法：
　　行星形膠質細胞培養(yǎng)，純化并傳至3-4代，最后1代細胞布滿瓶底時用于實驗。
　　1.為觀察舒巴坦對正常星形膠質細胞GLT-1表達的劑量依賴性，用終濃度為5μM，25μM和125μM的舒巴坦孵育正常的星形膠質細胞，于孵育48 h后收集細胞，免疫細胞化學和western blot法觀察不同劑量的舒巴坦對星形膠質細胞

18、GLT-1表達的影響。同時設溶劑對照組，培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑NS。
　　2.為觀察舒巴坦對正常星形膠質細胞GLT-1表達的時間進程，用終濃度為125μM舒巴坦孵育正常的星形膠質細胞，于舒巴坦孵育1 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h和72 h時收集細胞，免疫細胞化學和western blot法觀察舒巴坦的不同孵育時間對星形膠質細胞 GLT-1表達的影響。同時設溶劑對照組，培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑NS。

19、　　3.為觀察舒巴坦對正常星形膠質細胞 p-p38 MAPK表達的劑量依賴性，用終濃度為5μM，25μM和125μM的舒巴坦孵育正常的星形膠質細胞，于孵育48 h后收集細胞，免疫細胞化學和western blot法觀察不同劑量的舒巴坦對星形膠質細胞p-p38 MAPK表達的影響；于孵育24 h后收集細胞，觀察不同劑量的舒巴坦對星形膠質細胞總p38 MAPK表達的影響。同時設溶劑對照組，培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑NS。
　　4.觀察

20、舒巴坦對正常星形膠質細胞p-p38 MAPK表達的時間進程，用終濃度為125μM舒巴坦孵育正常的星形膠質細胞，于舒巴坦孵育1 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h和72 h時收集細胞，免疫細胞化學和western blot法觀察舒巴坦的不同孵育時間對星形膠質細胞p-p38 MAPK和總p38 MAPK表達的影響。同時設溶劑對照組，培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑NS。
　　結果：
　　1.在觀察舒巴坦對正常星形膠質細胞

21、 GLT-1表達的劑量依賴性實驗中，免疫細胞化學結果顯示：在溶劑對照組，GLT-1廣泛表達于培養(yǎng)的星形膠質細胞。應用舒巴坦孵育星形膠質細胞48 h，與對照組相比，5μM，25μM和125μM的舒巴坦顯著增加GLT-1的表達，這種上調呈劑量依賴性。Western blot分析顯示與免疫細胞化學結果相同。
　　2.在觀察舒巴坦對正常星形膠質細胞GLT-1表達的時間進程實驗中，免疫細胞化學結果顯示：在125μM的舒巴坦孵育后，與溶劑對照

22、組相比， GLT-1的表達從舒巴坦孵育12 h開始增加，48 h達到高峰，72 h仍維持在與較高水平。Western blot分析顯示與免疫細胞化學結果相同。
　　3.在觀察舒巴坦對正常星形膠質細胞p-p38 MAPK表達的劑量依賴性實驗中，免疫細胞化學結果顯示，在溶劑對照組，p-p38 MAPK主要表達于培養(yǎng)的星形膠質細胞細胞核，細胞漿也有少量表達，主要存在于細胞核周圍，且染色較淺，表達量較少；p38主要表達于星形膠質細胞的細胞

23、漿，并有大量表達。免疫細胞化學和Western blot法檢測均顯示：應用舒巴坦孵育星形膠質細胞3 h，與對照組相比，5μM，25μM和125μM的舒巴坦均顯著增加p-p38 MAPK的表達，且這種上調呈劑量依賴性。在舒巴坦組，應用5μM，25μM和125μM舒巴坦孵育星形膠質細胞24 h后，p38的表達與溶劑對照組相比無明顯差異。Western blot分析顯示與免疫細胞化學結果相同。
　　4.在觀察舒巴坦對正常星形膠質細胞GL

24、T-1表達的時間進程實驗中，免疫細胞化學和 Western blot法檢測結果均顯示，在溶劑對照組，p-p38 MAPK有少量的表達；在舒巴坦組，應用125μM的舒巴坦孵育正常的星形膠質細胞，與溶劑對照組相比，p-p38 MAPK的表達從舒巴坦孵育1 h開始增加，3 h達到高峰，24 h恢復到對照基礎水平。在舒巴坦組，應用125μM的舒巴坦孵育正常星形膠質細胞，總p38 MAPK的表達在任何時間點與溶劑對照組相比均無顯著性差異。

25、　　小結：
　　1.舒巴坦可上調正常星形膠質細胞的GLT-1表達，這種上調具有劑量依賴性和時間依賴性，舒巴坦孵育12 h開始增加，48 h達到高峰，72 h仍維持在與較高水平。
　　2.舒巴坦可上調正常星形膠質細胞的p-p38 MAPK表達，這種上調具有劑量依賴性和時間依賴性，且舒巴坦對總p38 MAPK的表達無影響， p-p38 MAPK的上調為p38 MAPK的磷酸化激活所致。p-p38 MAPK的上調從舒巴坦孵育1h開

26、始增加，3h達到高峰，24h恢復到對照基礎水平。
　　第三部分：抑制p38 MAPK通路阻斷舒巴坦引起的正常和OGD-處理的星形膠質細胞GLT-1的表達
　　目的：
　　應用單純星形膠質細胞培養(yǎng)技術，觀察 p-p38 MAPK抑制劑SB203580對正常和OGD-處理的星形膠質細胞中舒巴坦誘導的GLT-1上調的影響，探討p-p38 MAPK通路是否參與正常星形膠質細胞中舒巴坦誘導的GLT-1的上調。
　　方法：<

27、br>　　1.行星形膠質細胞培養(yǎng)，純化并傳至3-4代，最后1代細胞布滿瓶底時用于實驗，將細胞隨機分為以下4組：
　　(1)對照組：正常的星形膠質細胞在正常的培養(yǎng)基中孵育1 h+48 h，相當于SB203580與舒巴坦的共同孵育時間。
　　(2)舒巴坦組：在正常的培養(yǎng)基中孵育1 h后，換成終濃度為125μM舒巴坦的培養(yǎng)液中孵育48 h。
　　(3)SB203580+舒巴坦組：首先正常星形膠質細胞的培養(yǎng)基中加入SB2035

28、80孵育1 h，再加入終濃度為125μM的舒巴坦與SB203580共同孵育48 h，根據SB203580的不同劑量分為2.5μM,5μM和10μM三個亞組。同時設溶劑對照組，用DMSO代替SB203580。
　　(4)SB203580對照組：用終濃度為10μM的SB203580孵育正常星形膠質細胞1 h+48 h。
　　收集以上各組的星形膠質細胞后，應用免疫細胞化學和 western blot兩種方法觀察各組GLT-1的表達

29、，分析抑制p-p38 MAPK通路對正常星形膠質細胞中舒巴坦誘導的GLT-1上調的影響。
　　2.行星形膠質細胞培養(yǎng)，純化并傳至3-4代，最后1代細胞布滿瓶底時用于實驗，將細胞隨機分為以下4組：
　　(1)對照組：正常星形膠質細胞在正常的培養(yǎng)基中孵育1 h+48 h+2 h，(相當于SB203580先單獨孵育1 h、舒巴坦和SB203580共同孵育時間48 h和OGD的時間2 h)，換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h收

30、集細胞。
　　(2)OGD組：首先星形膠質細胞正常培養(yǎng)1 h+48 h后，進行2 h的OGD后，換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h收集細胞。
　　(3)舒巴坦+OGD組：星形膠質細胞在正常的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h，加入終濃度為125μM舒巴坦培養(yǎng)液中孵育48 h，其余步驟同OGD組。
　　(4)SB203580+舒巴坦+OGD組：正常星形膠質細胞首先在終濃度為2.5μM，5μM和10μM的SB203580的培養(yǎng)基中孵

31、育1 h，再加入舒巴坦使其終濃度為125μM，并與SB203580共同孵育48 h，其余步驟同OGD組，同時設溶劑對照組，用DMSO代替SB203580。
　　實驗各組于OGD復氧后12 h或24 h兩個時間點及對照組相應時間點收集細胞，應用免疫細胞化學和western blot法，觀察各組GLT-1的表達，分析抑制p-p38 MAPK通路對舒巴坦預孵育誘導OGD處理后的星形膠質細胞的GLT-1上調的影響。
　　結果：

32、>　　1.免疫細胞化學結果顯示，在對照組，GLT-1廣泛表達于培養(yǎng)的單純星形膠質細胞。與對照組相比，舒巴坦組應用125μM舒巴坦孵育星形膠質細胞后，GLT-1的表達顯著上調。與舒巴坦組相比，SB203580+舒巴坦組中應用2.5μM,5μM,10μM的SB203580孵育，GLT-1的表達明顯下調，且這種下調呈顯著的劑量依賴性。溶劑對照組，與舒巴坦組相比GLT-1的表達無明顯改變。與對照組相比，SB203580對照組中，用10μM的SB

33、203580孵育正常星形膠質細胞，GLT-1的基礎表達無明顯改變。
　　2.Western blot的結果與免疫細胞化學結果一致。與對照組相比，舒巴坦組的GLT-1表達顯著上調。與舒巴坦組相比，SB203580+舒巴坦組的GLT-1表達劑量依賴性的顯著下調。在 SB203580的溶劑對照組， SB203580的溶劑對舒巴坦誘導的GLT-1上調無影響。在SB203580對照組中，10μM的SB203580對基礎表達的GLT-1無明顯

34、影響。Western blot和免疫細胞化學的結果共同說明，SB203580劑量依賴的抑制舒巴坦誘導的正常星形膠質細胞的GLT-1的上調。
　　3.免疫細胞化學結果顯示：在對照組，GLT-1廣泛表達于培養(yǎng)的星形膠質細胞。與對照組相比，OGD組的GLT-1表達明顯下調，約為正常對照組的1/2-2/3。在舒巴坦+OGD組，與OGD組相比，125μM的舒巴坦預孵育48 h后，可以顯著上調星形膠質細胞的GLT-1表達，其表達是正常水平的1

35、.5-2倍。在SB203580+舒巴坦+OGD組，與舒巴坦+OGD組相比，2.5μM，5μM和10μM的SB203580可以顯著抑制舒巴坦預孵育誘導的星形膠質細胞 GLT-1的上調，這種抑制作用呈劑量依賴性，10μM的SB203580表現出最好的抑制效果。單獨加入SB203580的溶劑對舒巴坦預孵育誘導的星形膠質細胞GLT-1的上調無影響。
　　4.Western blot法檢測結果與免疫細胞化學結果相一致，結果顯示：與對照組相比

36、，OGD組的GLT-1表達明顯下調。在舒巴坦+OGD組，與OGD組相比，舒巴坦可以顯著上調星形膠質細胞GLT-1的表達；與舒巴坦+OGD組相比，SB203580+舒巴坦+OGD組的GLT-1的表達上調被顯著抑制，這種抑制呈劑量依賴性。SB203580的溶劑對舒巴坦預孵育誘導的GLT-1上調無影響。Western blot和免疫細胞化學的結果共同說明，SB203580可劑量依賴的抑制舒巴坦預孵育誘導的星形膠質細胞GLT-1的上調。

37、　　小結：
　　1.抑制 p38 MAPK通路阻斷了舒巴坦誘導的正常星形膠質細胞的GLT-1的上調，p38 MAPK通路參與了正常星形膠質細胞中舒巴坦誘導的GLT-1的上調。
　　2.抑制p38 MAPK通路阻斷舒巴坦引起的OGD處理后的星形膠質細胞GLT-1的表達，p38 MAPK通路參與了舒巴坦預孵育誘導的OGD后星形膠質細胞GLT-1的表達上調。
　　第四部分 抑制p38 MAPK通路阻斷舒巴坦介導的海馬神經元抗

38、OGD作用
　　目的：
　　應用神經元星形膠質細胞共培養(yǎng)技術，觀察p38 MAPK抑制劑SB203580對舒巴坦抗海馬神經元OGD作用的影響，探討p38 MAPK通路是否參與舒巴坦誘導的抗OGD損傷的神經元保護作用。
　　方法：
　　取24 h內新生鼠進行海馬神經元星形膠質細胞共培養(yǎng)10天后，將細胞隨機分為以下6組：
　　(1)對照組：正常培養(yǎng)基培養(yǎng)海馬神經元星形膠質細胞1 h+48 h+2 h+24 h，

39、以上時間段分別對應下面實驗分組中實驗處理的時間段，1 h+48 h對應SB203580孵育時間段，48 h對應舒巴坦孵育的時間段，2 h對應OGD的時間段，24 h對應OGD復氧后至收集細胞的時間段。
　　(2)OGD組：首先共培養(yǎng)細胞正常培養(yǎng)1+48 h后（對應SB203580孵育時間段），進行2 h氧葡萄糖剝奪后換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。
　　(3)舒巴坦+OGD組：共培養(yǎng)細胞先正常培養(yǎng)1 h，加入舒巴坦培養(yǎng)液中孵

40、育48 h，之后行OGD，方法同OGD組。
　　(4)SB203580+舒巴坦+OGD組：在含2%B27的NB培養(yǎng)基中，先加入 SB203580孵育1 h，培養(yǎng)液中加入終濃度為125μM的舒巴坦與SB203580繼續(xù)共同孵育48h，之后行OGD，方法同OGD組。根據SB203580的劑量進一步分為2.5μM,5μM和10μM3個亞組，以觀察其量效關系。
　　(5)舒巴坦對照組：先正常培養(yǎng)1 h，再加入終濃度為125μM的舒巴

41、坦孵育48小時，換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h+24 h。
　　(6)SB203580對照組：在正常培養(yǎng)的海馬神經元星形膠質細胞培養(yǎng)基中加入10μM的SB203580孵育1+48 h，換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h+24 h。
　　實驗各組于OGD復氧后24 h或相應時間點收集細胞，HO/PI染色觀察計數神經元死亡百分率；MTT法觀察細胞活力，觀察p38 MAPK抑制劑SB203580對舒巴坦抗OGD發(fā)揮神經元保護作用的影響。<

42、br>　　結果：
　　1.HO/PI雙重染色顯示，與對照組相比，125μM的舒巴坦單獨處理正常的共培養(yǎng)細胞對細胞的死亡率無影響，2 h的OGD可以顯著增加細胞死亡率，而125μM的舒巴坦預孵育48 h可以顯著降低由OGD引起的海馬神經元死亡。與舒巴坦+OGD組相比，SB203580+舒巴坦+OGD組應用2.5μM，5μM和10μM的SB203580后，細胞死亡率又明顯升高，這種效應呈明顯的劑量依賴性；在SB203580的溶劑對照組

43、，共培養(yǎng)的細胞死亡率與舒巴坦+OGD組相比無明顯差異，說明溶劑對舒巴坦預孵育對抗OGD而產生的神經元保護作用無影響。此外，在 SB203580對照組，與對照組相比，細胞死亡率無明顯改變，說明10μM的SB203580對正常的神經元無損傷致死作用。
　　2.MTT的結果顯示，與對照組相比，2 h的OGD可以顯著降低共培養(yǎng)細胞的細胞活力，而舒巴坦可以顯著增加由OGD引起的共培養(yǎng)細胞的細胞活力降低。與舒巴坦+OGD組相比，SB20358

44、0+舒巴坦+OGD組中SB203580明顯降低共培養(yǎng)的細胞活力，且具有劑量依賴性。在SB203580的溶劑對照組，共培養(yǎng)的細胞活力與舒巴坦+OGD組相比無明顯差異。在SB203580對照組，與對照組相比，細胞活力無明顯改變。以上結果結合HO/PI結果，說明SB203580可以劑量依賴的抑制舒巴坦預孵育對抗OGD而產生的神經元保護作用，p-p38 MAPK通路參與了海馬神經元膠質細胞共培養(yǎng)中舒巴坦對抗氧葡萄糖剝奪發(fā)揮的神經元保護作用。

45、r>　　小結：在神經元-星形膠質細胞共培養(yǎng)體系中，抑制p38 MAPK通路阻斷舒巴坦介導的海馬神經元抗OGD作用。
　　結論:
　　1.舒巴坦預孵育可劑量依賴性的對抗OGD引起的海馬神經元死亡，并可上調OGD后星形膠質細胞GLT-1表達，同時維持GLT-1的高表達直至OGD復氧后24 h，表明舒巴坦預孵育可能通過上調并維持星形膠質細胞的GLT-1的表達對抗OGD引起的海馬神經元死亡。
　　2.舒巴坦可劑量和時間依賴性的

46、上調正常星形膠質細胞 p-p38 MAPK和GLT-1表達，且p38的磷酸化活化明顯早于GLT-1表達上調。
　　3.抑制p-p38 MAPK阻斷舒巴坦誘導的正常和OGD后星形膠質細胞的GLT-1的上調，p38 MAPK通路參與了舒巴坦預孵育誘導的正常和OGD后星形膠質細胞GLT-1的表達上調。
　　4.抑制p-p38 MAPK阻斷舒巴坦預孵育對抗OGD發(fā)揮的海馬神經元保護作用。
　　5.以上表明，舒巴坦通過激活星形膠