噬菌體展示短肽親和配基的篩選及其親和色譜的研究.pdf

1、該文主要針對使用噬菌體展示系統(tǒng)獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)的親和配基和將該配基應(yīng)用于目標(biāo)蛋白質(zhì)的親和色譜分離進(jìn)行了研究.首先以溶菌酶為目標(biāo)蛋白質(zhì)篩選七肽噬菌體展示庫,在借鑒傳統(tǒng)肽庫篩選方法的基礎(chǔ)上,建立了一種新型篩選方法—交替洗脫法,即使用甘氨酸緩沖液和高濃度目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液輪流對結(jié)合于蛋白質(zhì)表面的噬菌體進(jìn)行洗脫.通過與其它多種洗脫方法進(jìn)行比較,以及將每輪實(shí)驗(yàn)各次洗脫液中噬菌體對目標(biāo)蛋白質(zhì)的親和力的對比,證明該方法能夠有效回收使用其它操作方法可能丟失的

2、高親和力噬菌體,而且可以大幅度縮短獲得目標(biāo)配體的時(shí)間,同時(shí)具有簡便易行等優(yōu)點(diǎn).利用新建立的交替洗脫法,使用其它目標(biāo)蛋白質(zhì)對噬菌體展示肽庫進(jìn)行篩選,又獲得了對胰島素和核糖核酸酶A具有高親和力的噬菌體.選擇與目標(biāo)蛋白質(zhì)親和力不等(高等、中等、低等)的多個(gè)噬菌體進(jìn)行DNA測序,獲得相應(yīng)氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)與溶菌酶、胰島素和核糖核酸酶A親和性最高的噬菌體展示肽序列均為HWWWPAS,將產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因進(jìn)行了分析,同時(shí)還對不同序列展示肽與目標(biāo)蛋白質(zhì)的

3、親和吸附機(jī)制進(jìn)行了探討.合成上述高親和性肽段,并固定于瓊脂糖基質(zhì)上裝填親和色譜柱,研究了不同蛋白在親和色譜柱上的吸附行為.通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度,并使用尿素和乙二醇分別對吸附蛋白進(jìn)行洗脫,詳細(xì)研究了吸附效果最好的目標(biāo)蛋白質(zhì)(胰島素)與肽配基之間的親和吸附機(jī)理,發(fā)現(xiàn)靜電作用和氫鍵是二者之間產(chǎn)生親和吸附的主要作用力,而疏水相互作用對該親和幾乎沒有貢獻(xiàn).進(jìn)一步考察了操作流速對胰島素在肽配基親和柱上吸附的影響,測定計(jì)算了胰島素在親和柱