熱休克蛋白70在Bcr-Abl細(xì)胞中抑制凋亡誘導(dǎo)因子的促凋亡作用.pdf

1、bcr/abl融合基因是慢性粒細(xì)胞白血?。–hronic myloid leukemia，CML）的分子標(biāo)志，該基因表達(dá)具有組成型激活的酪氨酸激酶活性的Bcr/Abl融合蛋白，能夠異常活化PI3K-AKT、Ras和STAT5等一系列信號(hào)通路，使血細(xì)胞惡性增殖和凋亡受阻。除此以外，Bcr/Abl融合蛋白表達(dá)的細(xì)胞中還能檢測(cè)到熱休克蛋白70（Hsp-70）表達(dá)水平增高， Hsp-70作為細(xì)胞應(yīng)激時(shí)的保護(hù)蛋白，近年來(lái)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中受到

2、廣泛關(guān)注。Hsp-70可抑制Bax的線粒體定位，從而抑制線粒體通路的細(xì)胞凋亡；也可在線粒體下游抑制Apaf-1對(duì)caspase-9的募集作用，從而阻斷caspase凋亡通路的活化。此外，Hsp-70還能抑制非caspase凋亡通路。凋亡誘導(dǎo)因子（Apoptosis-inducing factor，AIF）是非caspase凋亡途徑的重要分子，生理?xiàng)l件下，AIF表達(dá)后依賴其N端1-120的線粒體定位信號(hào)（MLS）定位于線粒體，輔助呼吸鏈的

3、電子傳遞。凋亡發(fā)生時(shí)，AIF易位至細(xì)胞核中，誘發(fā)基因組DNA斷裂，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在MEF細(xì)胞中，外源性過(guò)表達(dá)Hsp-70能夠阻斷AIF的細(xì)胞核定位，從而中和其促凋亡效應(yīng)。AIF的150-226作為Hsp-70結(jié)合位點(diǎn)，介導(dǎo) AIF與Hsp-70直接結(jié)合，這兩者之間的相互作用可能是Hsp-70影響AIF功能的主要途徑。
　　鑒于目前Hsp-70對(duì)AIF負(fù)性調(diào)節(jié)作用的研究基礎(chǔ)，和作者所研究的CML細(xì)胞中Hsp-70內(nèi)源性過(guò)表達(dá)，我們推

4、測(cè)，AIF及其所負(fù)責(zé)的非caspase凋亡通路在CML細(xì)胞中處于失活狀態(tài)，該狀態(tài)與CML的發(fā)病機(jī)制可能有關(guān)。為了證明這一推測(cè)，我們擬提出以下研究思路和方法：
　　首先，我們研究細(xì)胞在受到凋亡刺激時(shí)非caspase途徑的活化狀態(tài)以及AIF的功能。K562、32Dp210、Ba/F3p210以及各自的Bcr/Abl陰性對(duì)照細(xì)胞HL-60、32D、Ba/F3接受caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理阻斷caspase通路后，采用化

5、療藥物Vp-16誘導(dǎo)凋亡。采用FCM定量分析細(xì)胞凋亡，以驗(yàn)證非caspase通路在各細(xì)胞中的活化能力。通過(guò)western blotting和IFT方法檢測(cè)內(nèi)源性AIF的亞細(xì)胞定位。同時(shí)，在K562細(xì)胞中表達(dá)外源性攜帶HA標(biāo)簽的AIF突變體，該突變體缺失1-120氨基酸殘基的線粒體定位序列（dMLS-AIF），能夠靶向細(xì)胞核并起始凋亡。通過(guò)western blotting和IFT檢測(cè)外源性AIF的亞細(xì)胞定位，流式細(xì)胞術(shù)和瑞氏染色檢測(cè)細(xì)胞凋

6、亡。
　　其次，我們研究Bcr/Abl細(xì)胞Hsp-70的表達(dá)及其對(duì)AIF的影響。采用western blotting比較三株Bcr/Abl細(xì)胞、臨床CML病人骨髓細(xì)胞以及相應(yīng)的Bcr/Abl陰性對(duì)照細(xì)胞中的Hsp-70表達(dá)。通過(guò)酪氨酸酶抑制劑伊馬替尼（IM）處理細(xì)胞抑制Bcr/Abl蛋白激酶活性后檢測(cè)Hsp-70的表達(dá)變化以及其轉(zhuǎn)錄因子Hsf-1的活化水平。為證明Hsp-70的水平影響AIF的定位，我們通過(guò)siRNA靶向沉默Hsp

7、-70，采用CCK-8和FCM檢測(cè)細(xì)胞增殖、周期及凋亡。隨后在Vp-16誘導(dǎo)下，通過(guò)western blotting和IFT檢測(cè)AIF的亞細(xì)胞定位，并通過(guò)FCM和TEM方法檢測(cè)caspase途徑被抑制后細(xì)胞的凋亡。
　　最后，我們研究Hsp-70抑制AIF促凋亡功能的機(jī)制。通過(guò)co-IP檢測(cè)Bcr/Abl細(xì)胞在細(xì)胞凋亡時(shí)過(guò)表達(dá)的Hsp-70與釋放的AIF的結(jié)合，以及K562細(xì)胞中Hsp-70與外源性HA標(biāo)記的AIF突變體(dMLS

8、-AIF)的結(jié)合。并通過(guò)pull-down檢測(cè)不同細(xì)胞胞漿蛋白中Hsp-70與原核表達(dá)的AIF(HIS-AIF)蛋白的結(jié)合，以證明Hsp-70結(jié)合AIF的能力與其表達(dá)水平相關(guān)。為了證明AIF與過(guò)表達(dá)的Hsp-70結(jié)合是其入核受阻的原因，我們構(gòu)建了缺失Hsp-70結(jié)合域的AIF突變體（dHBD-AIF）以破壞兩者之間的相互作用，腺病毒介導(dǎo)在K562細(xì)胞中表達(dá)，采用co-IP驗(yàn)證其不能與Hsp-70結(jié)合，western blotting和I

9、FT檢測(cè)其亞細(xì)胞定位，最后通過(guò)FCM以及TEM分析dHBD-AIF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。
　　研究結(jié)果如下：
　　首先，Bcr/Abl細(xì)胞接受caspase抑制預(yù)處理后，Vp-16誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡完全受到抑制，而對(duì)照組細(xì)胞接受caspase抑制預(yù)處理后，凋亡率雖然下降，但仍明顯高于空白對(duì)照組。說(shuō)明在Bcr/Abl細(xì)胞中，非caspase通路處于失活狀態(tài)。AIF是非caspase通路的重要分子，Bcr/Abl細(xì)胞中，Vp-16未能

10、誘導(dǎo)AIF入核：IFT核western blotting結(jié)果均顯示，AIF主要定位于細(xì)胞漿中，而B(niǎo)cr/Abl陰性對(duì)照細(xì)胞中，AIF則明顯在細(xì)胞核中聚集。同時(shí)，缺失線粒體定位信號(hào)的AIF突變體（dMLS-AIF）也主要在K562細(xì)胞胞漿中表達(dá)。
　　其次，在K562、32D p210和Ba/F3p210三株細(xì)胞中，Hsp-70的水平是其Bcr/Abl陰性對(duì)照細(xì)胞HL-60、32D和Ba/F3的4-6倍；與正常人相比，CML病人骨髓

11、細(xì)胞Hsp-70上調(diào)可高達(dá)上百倍。上調(diào)的Hsp-70與Bcr/Abl蛋白有關(guān)，IM處理可通過(guò)抑制Hsf-1活性下調(diào)Hsp-70的水平，且表現(xiàn)出時(shí)間與濃度的依賴性。siRNA抑制Hsp-70后，結(jié)果顯示，細(xì)胞的生物學(xué)特征的改變與Hsp-70沉默效果相關(guān)，Hsp-70的沉默效果達(dá)到80％時(shí)，細(xì)胞周期受抑，凋亡增加；沉默效果達(dá)到60%時(shí)，僅細(xì)胞增殖受到影響，未有明顯的凋亡發(fā)生；10-20%沉默效果未能引起明顯生物學(xué)行為改變。Hsp-70沉默亦

12、可增加Bcr/Abl細(xì)胞對(duì)Vp-16的敏感性：Hsp-70沉默組的細(xì)胞在Vp-16作用下凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組，Hsp-70沉默后，Vp-16能夠成功誘導(dǎo)內(nèi)源AIF以及外源dMLS-AIF入核。
　　最后，與對(duì)照組相比，Bcr/Abl細(xì)胞中高表達(dá)的Hsp-70能夠結(jié)合凋亡誘導(dǎo)時(shí)釋放的AIF，K562細(xì)胞中外源表達(dá)的dMLS-AIF亦可與Hsp-70結(jié)合。因不同細(xì)胞中Hsp-70表達(dá)量的差異，所結(jié)合的AIF也不同，與K562、32

13、D p210細(xì)胞的胞漿蛋白共孵育的His-AIF蛋白主要呈結(jié)合狀態(tài)，而與HL-60、32D胞漿蛋白共孵育后，His-AIF蛋白主要存在于穿梭液中。同時(shí)，外源表達(dá)dHBD-AIF能夠破壞與Hsp-70的結(jié)合，dHBD-AIF定位于胞核中，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在形態(tài)學(xué)上可見(jiàn)細(xì)胞的凋亡發(fā)生在染色質(zhì)邊集化的早期階段。
　　綜上所述，Bcr/Abl細(xì)胞異常表達(dá)的Hsp-70通過(guò)結(jié)合AIF抑制非caspase凋亡通路的活化，下調(diào)Hsp-70可以抑