NF-κB-HIF-1α通路對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響.pdf

1、癲癇發(fā)作，尤其是癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)可造成腦組織，特別是海馬組織廣泛性損傷，但其確切機(jī)制尚未完全闡明。研究表明癲癇發(fā)作后產(chǎn)生的腦部炎癥反應(yīng)參與了癲癇的發(fā)生和發(fā)展，并對(duì)神經(jīng)元的損傷起著重要作用，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是炎性反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)，癲癇腦內(nèi)存在NF-κB的異常激活。我們前期研究證實(shí):抑制NF-κB能明顯減輕癲癇所致的神經(jīng)元損傷，起到腦保護(hù)作用，但具體調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。癲癇頻繁發(fā)作常伴

2、隨著大腦缺氧，且海馬區(qū)域尤為突出。低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)廣泛存在的一類(lèi)核轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α作為低氧的標(biāo)志在癲癇腦組織中表達(dá)顯著增加，但過(guò)表達(dá)的HIF-1α對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用還是損害作用？目前尚不清楚。腫瘤和消化系統(tǒng)的研究中均發(fā)現(xiàn)，HIF-1α表達(dá)受NF-κB的調(diào)控，NF-κB是HIF-1α活化所必需的轉(zhuǎn)錄因子，抑制NF-κB/HIF-1α通路的活化能抑制腫瘤的生長(zhǎng)和減輕腸道屏障功能紊亂。那么，癲癇病理

3、過(guò)程中，NF-κB是否通過(guò)調(diào)控HIF-1α導(dǎo)致癲癇發(fā)作后神經(jīng)元的損害？抑制NF-κB/HIF-1α通路的激活能否減輕癲癇后的腦損傷？目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探討NF-κB、HIF-1α在SE癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷中的作用及相互關(guān)系，以期進(jìn)一步闡明癲癇發(fā)作后腦損傷的機(jī)制。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 HIF-1α的過(guò)表達(dá)對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響
　　目的:探討HI

4、F-1α對(duì)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬神經(jīng)元損傷的影響。
　　方法:選擇125只成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分成4組:生理鹽水對(duì)照組(Control，n=25)、SE模型組(SE，n=50)、二甲基亞砜（DMSO，HIF-1α的溶解劑）假性治療組(SE+DMSO，n=25)、HIF-1α抑制劑2-甲氧雌二醇(2ME2)治療組(SE+2ME2，n=25)，其中SE組根據(jù)觀(guān)察時(shí)間分為6h、12h、24h、48h、72h。采用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注

5、射法制作SE模型，SE+2ME2組大鼠在注射匹羅卡品前15min，給予15mg/kg2ME2腹腔注射1次，SE+DMSO組大鼠在注射匹羅卡品前15min，給予等量DMSO腹腔注射1次，SE+2ME2組和SE+DMSO組大鼠于癲癇發(fā)作后24h處死。觀(guān)察各組大鼠癲癇發(fā)作情況;采用Western blotting檢測(cè)海馬中HIF-1α和活化的半胱氨酸門(mén)冬氨酸特異性蛋白酶3(cleavedcaspase-3)凋亡蛋白的表達(dá)水平;采用免疫組織化學(xué)

6、法檢測(cè)海馬HIF-1α和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)部位和表達(dá)變化;采用Fluoro-Jade C(FJC)染色法評(píng)估海馬神經(jīng)元損害情況。
　　結(jié)果:SE組、SE+DMSO組和SE+2ME2組大鼠造模成功率(90％、88％、92％;P＞0.05);發(fā)作嚴(yán)重導(dǎo)致的死亡率(33％、36％、30％;P＞0.05);初次到達(dá)Ⅳ級(jí)發(fā)作時(shí)間(SOT4)(32.36±10.05、33.95±9.668、34.87±11.28;P＞

7、0.05)和初次達(dá)到Ⅴ級(jí)時(shí)間(SOT5)（40.80±9.855、41.73±10.34、43.17±10.40;P＞0.05）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Western blotting檢測(cè)顯示，和生理鹽水對(duì)照組相比(0.151±0.083，0.060±0.017)，海馬HIF-1α和cleaved caspase-3從癲癇發(fā)作6h、12h、24h、48h和72h后蛋白表達(dá)(0.337±0.116，0.180±0.045;0.701±0.16

8、8，0.195±0.037;1.017±0.080,0.284±0.0535;0.646±0.114,0.240±0.051;0.370±0.063,0.181±0.037)均增加(P＜0.05)，其中HIF-1α在24h表達(dá)最高，cleaved caspase-3在6h到72h間表達(dá)均處在較高水平;和SE24h亞組相比，SE+2ME2組大鼠海馬內(nèi)HIF-1α蛋白(0.259±0.071)表達(dá)經(jīng)2ME2處理后降低(P＜0.05)，其下游

9、cleaved caspase-3蛋白（0.210±0.051）表達(dá)也同樣降低(P＜0.05);免疫組織化學(xué)染色顯示SE+2ME2組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)HIF-1α（64535±16278，114860±25150）和cleaved caspase-3（38360±5173，58596±19940）染色的累計(jì)光密度值(IOD)均比SE24h亞組(201658±40978，339091±24972;87308±14710，48662±

10、27198)下降(P＜0.05); FJC神經(jīng)元變性染色發(fā)現(xiàn):SE+2ME2組大鼠海馬CA1區(qū)(43.330±5.508)和CA3區(qū)(36.67±6.028)變性神經(jīng)元數(shù)目比SE24h亞組(95.33±11.68，88.67±7.767)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:癲癇大鼠海馬HIF-1α的表達(dá)增加，抑制HIF-1α表達(dá)能通過(guò)減少凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)，減少海馬神經(jīng)元死亡，發(fā)揮腦

11、保護(hù)作用。
　　第二部分 NF-κB通過(guò)上調(diào)HIF-1α促進(jìn)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元損傷
　　目的:探討NF-κB/HIF-1α在癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）大鼠海馬神經(jīng)元損傷中的調(diào)控作用。
　　方法:選擇110只成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分成7組:生理鹽水對(duì)照組(Control，n=15)、假手術(shù)組（Sham，n=15）、SE模型組(SE，n=20)、NF-κB特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基

12、甲酸鹽(PDTC)組(n=15)、SE+PDTC干預(yù)組(SE+PDTC，n=15)、SE+HIF-1α siRNA側(cè)腦室注射干預(yù)組(SE+HIF-1α siRNA，n=15)、SE+Control siRNA側(cè)腦室注射假性干預(yù)組(SE+Control siRNA，n=15)。采用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射法制作SE模型，觀(guān)察大鼠癲癇發(fā)作情況，造模后24 h采用蛋白免疫印跡分析檢測(cè)海馬中NF-κB p65和HIF-1α的表達(dá)水平;采用Flu

13、oro-Jade C(FJC)染色法檢測(cè)海馬退行性變神經(jīng)元。
　　結(jié)果:SE后24 h，海馬NF-κB p65和HIF-1α核蛋白含量(0.57±0.06、0.47±0.07)比Control組(0.23±0.03、0.20±0.03)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);PDTC干預(yù)后，海馬核蛋白NF-κB p65和HIF-1α含量(0.23±0.03、0.14±0.03)比SE組降低，CA1區(qū)FJC陽(yáng)性細(xì)胞(28.33±5

14、.03)比SE組(76.67±13.32)也減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);SE大鼠側(cè)腦室注射HIF-1α siRNA后，海馬HIF-1α全蛋白含量(0.22±0.03)比SE組(0.39±0.06)降低，CA1區(qū)FJC陽(yáng)性細(xì)胞(27.34±7.02)比SE組(76.67±13.32)也減少，差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:癲癇發(fā)作可導(dǎo)致腦內(nèi)NF-κ B/HIF-1α通路活化，抑制NF-κB/HIF-1