河北省結核分枝桿菌臨床分離株基因分型、表型耐藥及耐藥相關基因突變特征研究.pdf

1、目的：初步探討結核分枝桿菌散在重復單位-數(shù)目可變串聯(lián)重復序列（Mycobacterialinterspersedrepetitiveunits-variablenumbertandemrepeats，MIRU-VNTR）技術和間隔區(qū)寡核苷酸（Spaceroligonucleotidetyping，Spoligotyping）技術在河北省結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）臨床分離株的分子流行病學研究

2、中的應用，初步了解河北省MTB臨床分離株的基因型及其分布特征；通過藥物敏感試驗和耐藥基因測序，初步了解河北省MTB臨床分離株的耐藥情況，探討表型耐藥與耐藥相關基因突變之間、基因型與表型耐藥之間以及基因型與耐藥相關基因突變之間的相關性，評價耐藥相關基因位點檢測對MTB表型耐藥的臨床診斷價值，為建立耐藥結核分枝桿菌分子生物學快速檢測技術提供科學依據(jù)。
　　方法：從2014年1月至2014年12月，共收集到1017株河北省MTB臨床分離

3、株及相應的病例背景資料。采用PNB/TCH鑒別培養(yǎng)基和多位點PCR進行菌種鑒定，采用L-J固體培養(yǎng)基比例法進行一線抗結核藥物（異煙肼、利福平、鏈霉素和乙胺丁醇）的藥物敏感試驗，采用15位點MIRU-VNTR和Spoligotyping進行基因分型研究，采用基因測序技術對7個耐藥相關基因位點（rpsL、rrs、katG、inhA、oxyR-ahpC間隔區(qū)、rpoB和embB）進行序列分析，采用BioNumerics5.0軟件進行聚類分析、

4、GraphPadPrism5.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　結果：
　　1、河北省MTB菌株對四種一線抗結核藥物的總耐藥率為34.1％，MDR總耐藥率為13.2%。初始耐藥率為26.6%，初始MDR耐藥率為6.1%；獲得性耐藥率59.7%，獲得性MDR耐藥率為37.6%。獲得性耐藥率和獲得性MDR耐藥率均分別顯著高于初始耐藥率和初始MDR耐藥率（P值均<0.0001）。
　　2、河北省結核分枝桿菌表現(xiàn)出高度的基因多態(tài)性。S

5、poligotyping顯示，北京家族占90.5%，非北京家族占9.5%。非北京家族以T基因型為主，也發(fā)現(xiàn)了LAM、MANU、H、U等基因型。MIRU-VNTR將1017株MTB菌株分成16個基因群，共846種VNTR基因型。Spoligotyping和15位點MIRU-VNTR的HGDI值分別為0.279和0.999。
　　3、北京家族與非北京家族在患者年齡、性別、治療史及表型耐藥的分布方面均無統(tǒng)計學差異。北京家族菌株的成簇率顯

6、著高于非北京家族菌株的成簇率（P<0.0001）。rpsL、embB基因在北京家族菌株中的突變率顯著高于其在非北京家族菌株中的突變率（P值分別為0.0051和0.0180）。
　　4、rpsL基因43位點的突變率為56.0%；rrs基因的突變率為17.0%；katG基因315位點的突變率為62.3%；inhA基因-15位點的突變率為14.1%；oxyR-ahpC間隔區(qū)的突變率10.5%；rpoB基因531位點的突變率為53.7%；

7、embB基因306位點的突變率為56.5%。
　　5、隨著耐藥種類的增加，rpsL43、katG315、rpoB526/531和embB306位點的突變率呈遞增的趨勢（趨勢P值均<0.0001）。rpsL43、katG315、rpoB526/531和embB306在MDR菌株中的突變率均顯著高于在非MDR菌株中的突變率（P值分別為0.0136、<0.0001、<0.0001和<0.0001）。rpoB526/531和embB306

8、聯(lián)合檢測MDR表型耐藥的靈敏度為83.2%，特異度為80.8%。
　　結論：
　　1、河北省MTB菌株對一線抗結核藥物的總耐藥率及MDR耐藥率與全國平均水平相當。MTB菌株耐藥性的產(chǎn)生與抗結核藥物治療有關。
　　2、河北省結核分枝桿菌存在明顯的基因多態(tài)性，北京家族為主要流行株。15位點MIRU-VNTR基因分型法的分辨能力高于spoligotyping基因分型法的分辨能力。15位點MIRU-VNTR和spoligoty

9、ping相結合，能夠準確全面地分析河北省結核分枝桿菌的基因多態(tài)性。
　　3、北京家族菌株在河北省的近期傳播能力比非北京家族更強。rpsL和embB基因突變與北京家族菌株有關，提示鏈霉素和乙胺丁醇對北京家族菌株的臨床治療效果可能較差，這種適應性代價使北京家族菌株能夠更好地適應環(huán)境，從基因水平解釋了北京家族菌株廣泛傳播的原因。
　　4、rpsL43、katG315、rpoB526/531和embB306位點的突變率隨耐藥種類增加