Th22細胞及相關(guān)因子在結(jié)直腸癌的表達及作用機理探討.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 Th22細胞及相關(guān)因子在結(jié)直腸腫瘤微環(huán)境的表達及臨床意義
　　目的：Th22細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型輔助性T細胞，在芳香族受體(AHR)的啟動下主要分泌IL-22發(fā)揮功能作用，其早期研究主要集中在炎癥性疾病與自身免疫性疾，在結(jié)直腸腫瘤微環(huán)境中的作用機制尚不清楚。本部分檢測Th22細胞及相關(guān)因子在結(jié)直腸癌的表達分布情況，探討其可能機制及臨床意義。
　　方法：選取來自廣西醫(yī)

2、科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科2013年4月至2014年3月行結(jié)直腸癌切除手術(shù)的患者50例，所有患者均經(jīng)病理證實為結(jié)直腸癌，并且能夠經(jīng)手術(shù)切除腫瘤。所有患者在手術(shù)前均沒有接受放療或化療，術(shù)前無感染病史，既往無免疫性疾病病史，具有多個原發(fā)灶的患者也被排除?；颊哌M行大腸癌手術(shù)切除時收集新鮮的腫瘤組織和癌旁組織（距離病灶5cm以上的正常大腸組織）進行實驗。通過免疫組化方法驗證Th22細胞的功能因子IL-22在結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中是否表達;使

3、用流式細胞術(shù)檢測結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織Th22細胞比例的變化，結(jié)合臨床病理資料分析其臨床意義;使用實時熒光定量PCR方法從基因水平證實檢測結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中Th22細胞相關(guān)因子的表達情況，探討Th22細胞分布差異的可能機制。
　　結(jié)果：免疫組織化學(xué)技術(shù)對10例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁組織進行免疫組化染色結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁組織中均存在IL-22蛋白的表達，但腫瘤組織中表達更為明顯。通過流式細胞術(shù)，以散射光

4、FSC/SSC及CD4+T細胞亞群設(shè)門，分析Th22細胞的比例變化，結(jié)果顯示Th22細胞在結(jié)直腸癌組織中的表達量明顯高于癌旁的正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05;受檢的結(jié)直腸癌組織中，TNMⅢ-Ⅳ期的Th22細胞比例明顯高于TNMⅠ-Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05;提示Th22細胞結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中聚集，并且隨著腫瘤的進展含量增高。分析在結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中Th22細胞及Th17細胞的相關(guān)性顯示，結(jié)直腸癌組織中Th22細胞

5、的比例與Th17細胞的比例變化呈正相關(guān)，R=0.52，P＜0.05。
　　對50例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁正常組織的細胞因子進行了實時熒光定量PCR檢測，以β-actin為內(nèi)參基因計算相關(guān)因子的相對表達量。已知Th22細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子為AHR，主要分泌IL-22;其表型特征為CCR4、CCR6和CCR10，對應(yīng)的配體分別為CCL22、CCL20和CCL27。結(jié)果顯示與癌旁正常組織相比，Th22細胞的功能因子IL-22和轉(zhuǎn)錄因

6、子AHR結(jié)直腸癌組織中表達明顯增高，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;該結(jié)果與免疫組化及流式細胞術(shù)的結(jié)果保持一致。趨化因子CCL20和CCL22在結(jié)直腸癌組織中表達明顯比癌旁組織增高，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，趨化因子CCL27在結(jié)直腸癌組織的相對表達量也較癌旁組織增高，但無統(tǒng)計學(xué)差異，P＞0.05。提示腫瘤微環(huán)境中含有大量Th22細胞相關(guān)的趨化因子。
　　結(jié)論：Th22淋巴細胞表達存在于結(jié)直腸癌組織及癌旁正常大腸組織中

7、，Th22細胞在結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中高度表達，并且隨著腫瘤的分期進展比例增高;通過腫瘤微環(huán)境的細胞因子分析表明，Th22細胞在結(jié)直腸癌中聚集，可能與腫瘤微環(huán)境所分泌的細胞因子對Th22細胞的趨化作用有關(guān)。
　　第二部分 IL-22在體外對大腸癌的作用研究
　　目的：通過IL-22在體外與結(jié)腸癌細胞株進行共培養(yǎng)，研究IL-22對大腸癌的作用，并使用STAT3抑制劑進行干預(yù)，對其可能作用機制進行探討。
　　方法：購買人結(jié)腸

8、癌RKO細胞株，進行復(fù)蘇、常規(guī)培養(yǎng)、傳代，取生長狀態(tài)良好、對數(shù)期的細胞進行種板培養(yǎng)，使用細胞因子進行干預(yù)實驗。將細胞培養(yǎng)12孔板分為空白對照組、IL-22干預(yù)組、IL-22聯(lián)合STAT3抑制劑干預(yù)組三個小組，觀察結(jié)腸癌細胞的增殖、凋亡情況。通過流式細胞術(shù)，使用凋亡試劑盒AnnxmⅤ PE和7-AAD觀察細胞凋亡比例;使用細胞增殖相關(guān)的核抗原物質(zhì)Ki-67抗體檢測結(jié)腸癌細胞的增殖比例;統(tǒng)計分析各組的差異。
　　結(jié)果：通過IL-22與

9、人結(jié)腸癌RKO細胞株在體外共培養(yǎng)或IL-22聯(lián)合STAT3抑制劑(S3I-201)與人結(jié)腸癌RKO細胞株在體外共培養(yǎng)或來判斷IL-22在體外對結(jié)腸癌凋亡作用的影響及可能機制。通過流式細胞技術(shù)檢測RKO結(jié)腸癌細胞的凋亡率我們可以發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，IL-22可以明顯抑制結(jié)腸癌細胞的凋亡，降低凋亡率，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;當(dāng)IL-22聯(lián)合STAT3抑制劑與結(jié)腸癌細胞進行共培養(yǎng)時，IL-22抑制結(jié)腸癌細胞凋亡的作用完全被逆轉(zhuǎn)，P

10、＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明Th22細胞的功能因子IL-22對大腸癌凋亡有抑制作用，其機制可能是通過STAT3信號通路來完成的。
　　通過IL-22與人結(jié)腸癌RKO細胞株在體外共培養(yǎng)或IL-22聯(lián)合STAT3抑制劑(S3I-201)與人結(jié)腸癌RKO細胞株在體外共培養(yǎng)或來判斷IL-22在體外對結(jié)腸癌增殖作用的影響及可能機制。通過流式細胞技術(shù)檢測RKO結(jié)腸癌細胞的增殖比例我們可以發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，IL-22可以明顯促進結(jié)腸

11、癌細胞的增殖，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;當(dāng)IL-22聯(lián)合STAT3抑制劑與結(jié)腸癌細胞進行共培養(yǎng)時，IL-22促進結(jié)腸癌細胞增殖的作用完全被逆轉(zhuǎn)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明Th22細胞的功能因子IL-22對大腸癌的增殖具有促進作用，其機制可能是通過STAT3信號通路來完成的。
　　結(jié)論：本部分研究通過IL-22與結(jié)腸癌細胞株體外共培養(yǎng)，闡明IL-22在結(jié)腸癌中起到促癌的作用，抑制了結(jié)腸腫瘤細胞的凋亡，促進增殖;其作用

12、效應(yīng)可以被STAT3抑制劑所逆轉(zhuǎn)，提示IL-22可能是通過STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮作用的。
　　第三部分 IL-22在小鼠大腸癌動物模型的作用研究
　　目的：目前針對Th22細胞的功能研究主要是通過其功能因子IL-22來進行，前面部分研究結(jié)果表明IL-22在體外對結(jié)腸癌細胞株具有保護作用，促進腫瘤細胞生長以及抑制凋亡。本部分研究通過BALB/c裸鼠動物建立結(jié)腸癌皮下移植瘤模型，使用IL-22及STAT3抑制劑進行干預(yù)，探

13、討IL-22在體內(nèi)對大腸癌生長的作用及可能機制。
　　方法：常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌RKO細胞株，待細胞生長狀態(tài)良好處于對數(shù)期時消化，以生理鹽水調(diào)整細胞濃度，注射在BALB/c裸鼠皮下，建立結(jié)腸癌小鼠皮下移植瘤動物模型。待小鼠腫瘤體積達到60mm3時隨機分成3組（A組:空白對照組，B組:IL-22， C組:IL-22+STAT3抑制劑）隔天進行腹腔注射干預(yù)，隔天一次共5次，觀察各組小鼠腫瘤生長情況，第11天頸椎脫臼法處死，完整切除腫瘤，游標

14、卡尺測量計算終體積進行統(tǒng)計分析。稱取一定量的小鼠腫瘤組織，進行勻漿，收集組織勻漿上清液，使用液相芯片技術(shù)檢測各組小鼠腫瘤中IL-22蛋白的含量。
　　結(jié)果：本研究使用RKO結(jié)腸癌細胞進行小鼠皮下結(jié)腸癌模型的建立成功，飼養(yǎng)1周后所有的BALB/c裸鼠均成瘤，皮下可以觸及;腫瘤體積達到60mm3時隨機分成3組，腹腔注射藥物進行干預(yù)。三組小鼠在給藥過程中未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，空白對照組小鼠腫瘤緩慢平穩(wěn)生長，而IL-22干預(yù)組小鼠腫瘤生長

15、迅速，與對照組相比，第11天時腫瘤體積明顯增大，638mm3±58mm3 vs.428mm3±51mm3，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;而IL-22聯(lián)合S3I-201進行給藥時，IL-22對小鼠結(jié)腸癌生長的促進作用明顯被逆轉(zhuǎn)，第11天時腫瘤體積顯著小于IL-22組，313mm3±38mm3 vs.638mm3±58mm3，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明IL-22可以在體內(nèi)促進結(jié)腸癌的生長，其作用機制可能是通過STAT3信號通路來

16、實施。
　　為了進一步證實IL-22在體內(nèi)對結(jié)腸癌生長的作用，我們對三組結(jié)腸癌小鼠皮下移植腫瘤進行組織勻漿，通過Luminex液相芯片系統(tǒng)檢測小鼠腫瘤中IL-22蛋白的含量。結(jié)果表明，單獨IL-22干預(yù)組小鼠腫瘤中IL-22蛋白的含量明顯比空白對照組增高，124.1pg/ml±14.9pg/ml vs.25.36pg/ml±4.1pg/ml，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;然而，單獨IL-22干預(yù)組與IL-22聯(lián)合S3I-201干

17、預(yù)組小鼠腫瘤中IL-22蛋白的含量相比無明顯差別，124.1pg/ml±14.9pg/mlvs.118.3pg/ml±13.5pg/ml，P＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。表明IL-22確實在結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中聚集并能夠促進腫瘤生長，與第一部分人體標本的檢測結(jié)果類似。
　　結(jié)論：本部分研究通過BALB/c裸鼠建立結(jié)腸癌皮下移植瘤動物模型，使用IL-22及STAT3抑制劑進行干預(yù)，在體內(nèi)證實了IL-22對結(jié)腸癌生長的促進作用，其作用機制可