雞CD3和IL-2分子單克隆抗體的研制與鑒定.pdf

1、雞CD3分子是T細胞表面的重要標志之一，在抗原識別過程中，CD3分子參與信號傳導。針對雞CD3分子的特異性單克隆抗體(McAb)可用于測定或分選雞體內CD3+T細胞群，從而了解雞體的細胞免疫功能狀態(tài)，進行細胞免疫機理的深入研究。雞白細胞介素2(chickeninterleukin-2，ChIL-2)是主要由激活的T細胞和部分B細胞產生的一種糖蛋白，可激活T淋巴細胞，促進B細胞增殖和分泌抗體，增強NK細胞的活性等，是一種天然的免疫增強劑。

2、針對雞IL-2的特異性McAb可用于建立簡單、快速、敏感性高的雞IL-2檢測方法，同時為IL-2在禽類免疫系統中的免疫生物學研究提供有用的工具。本研究分別用表達雞CD3和IL-2分子的重組真核表達質粒免疫6周齡BALB/c小鼠，制備出能穩(wěn)定分泌抗雞CD3和IL-2分子的特異性McAb細胞株，并對McAb的部分生物學特性進行鑒定，為其進一步應用奠定基礎。 一、重組質粒pcDNA3.1-IL-2的構建及表達通過PCR擴增出雞IL-2

3、cDNA片段，并將其克隆入真核表達載體pcDNA3.1(+)中，構建重組真核表達質粒pcDNA3.1-IL-2，經酶切鑒定正確后轉染COS-7細胞，間接免疫熒光結果顯示，雞IL-2能在真核細胞中獲得表達。 將重組原核表達質粒pET-IL-2轉化宿主菌BL21(DE3)，重組菌小量提取質粒后經酶切鑒定正確；將重組菌用IPTG(0.1mM終濃度)誘導4h后，收獲細菌，SDS-PAGE結果表明目的蛋白成功表達；誘導菌經超聲波裂解后，分

4、別取沉淀和上清進行SDS-PAGE，結果顯示，目的蛋白主要以包涵體形式存在；包涵體經PBS洗滌3次后得到初步純化，將其溶于6M鹽酸胍溶液。 二、雞IL-2McAb的研制與鑒定應用淋巴細胞雜交瘤技術，以重組真核表達質粒pcDNA3.1-IL-2免疫6周齡BALB/c小鼠，100μg/只，后腿肌肉注射，間隔時間為2～3周，加強免疫后7d左右按常規(guī)方法融合，以原核表達雞IL-2蛋白為檢測抗原，間接ELISA篩選陽性克隆，共獲得抗雞IL

5、-2McAb2株，分別命名為：1H10和1E6。腹水效價分別為：1∶6400和1∶3200；亞類鑒定結果均為IgM。轉染試驗結果表明，2株McAb均與轉染pcDNA3.1-IL-2的COS-7細胞反應。Western-blot結果顯示，兩株McAb均與23KD條帶處的融合蛋白His-ChIL-2發(fā)生反應，進一步證明McAb1H10和1E6是針對雞IL-2的特異性McAb。 三、雞CD3McAb的研制與鑒定將重組真核表達質粒pcD

6、NA3.1-CD3免疫6周齡BALB/c小鼠，100μg/只，后腿肌肉注射，免疫間隔時間為2～3周。加強免疫后一周左右取小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞Sp2/0-Ag-14融合，以雞的脾細胞為檢測抗原，用間接免疫熒光結合ELISA方法進行篩選，共獲得抗雞CD3McAb7株，分別命名為：IA10、3E3、3G10、5F3、8D1、9E7和15A11；7株McAb的腹水IFA效價在1∶800～1∶6400之間，ELISA效價在1∶3200～1∶25

7、600之間；亞類鑒定結果表明，除15A11為IgG2a外，其余均為IgM。用這些McAb的細胞上清作為一抗來檢測轉染pcDNA3.1-CD3的COS-7細胞中CD3分子的表達，結果均呈陽性。用間接免疫熒光測定制備的抗雞CD3McAb的反應譜，結果顯示，9E7、5F3和3E3腹水與狼山雞、大骨雞、仙居雞、北京油雞、絲羽烏骨雞、白耳雞、尤溪麻雞和清遠麻雞的脾淋巴細胞均能反應，其它McAb與這些品種雞的脾細胞反應不一。用制備的抗雞CD3雜交瘤