大蒜素通過(guò)抑制凋亡通路減少順鉑誘導(dǎo)的耳毒性研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 大蒜素通過(guò)抑制凋亡通路減少順鉑誘導(dǎo)的聽(tīng)力損失
　　目的:利用C57小鼠腹腔注射順鉑制造藥物性聽(tīng)力損失模型，用順鉑聯(lián)合大蒜素腹腔注射來(lái)探討大蒜素在體內(nèi)對(duì)順鉑誘導(dǎo)的聽(tīng)力損失是否具有保護(hù)作用。
　　方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所用C57小鼠性別匹配，年齡在7-8周，體重17-23g。小鼠被隨機(jī)分為三組，每組30只;第1組，0.9％生理鹽水注射為對(duì)照組;第2組，順鉑注射;第3組，順鉑+大蒜素注射

2、。第1組小鼠給予連續(xù)七天腹腔注射0.9％生理鹽水（0.6毫升/100克）。第2組小鼠給予連續(xù)七天腹腔注射順鉑(3毫克/公斤)。第3組小鼠在順鉑注射前一天腹腔注射大蒜素（18.2毫克/公斤），在接下來(lái)的連續(xù)七天先腹腔注射大蒜素，2小時(shí)之后再腹腔注射順鉑（3毫克/公斤），用藥前和用藥后檢測(cè)三組小鼠的聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)，TUNEL凋亡試劑盒檢測(cè)三組小鼠耳蝸外毛細(xì)胞、支持細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的凋亡情況。對(duì)三組小鼠耳蝸中剩余的外毛細(xì)胞和螺旋

3、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)，用透射電鏡觀察外毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中線粒體情況，用Western blot檢測(cè)三組耳蝸組織中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3的表達(dá)情況，免疫熒光檢測(cè)三組小鼠耳蝸外毛細(xì)胞中P53的表達(dá)和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中細(xì)胞色素-C、cleaved-caspase-9及cleaved-caspase-3的表達(dá)情況，檢測(cè)三組小鼠耳蝸組織中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(

4、SOD)水平。
　　結(jié)果:ABR結(jié)果表明，C57小鼠單獨(dú)腹腔注射順鉑組表現(xiàn)出聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)的閾值增加，而大蒜素+順鉑組小鼠的聽(tīng)覺(jué)功能的大部分頻率受到保護(hù)。順鉑引起耳蝸外毛細(xì)胞及底轉(zhuǎn)、中轉(zhuǎn)的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元計(jì)數(shù)減少，大蒜素能保護(hù)順鉑引起的耳蝸外毛細(xì)胞及耳蝸中轉(zhuǎn)的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示:順鉑引起耳蝸外毛細(xì)胞、支持細(xì)胞及耳蝸底轉(zhuǎn)和中轉(zhuǎn)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡，大蒜素能明顯地減少順鉑誘導(dǎo)的凋亡情況。透射電鏡結(jié)果顯示:大蒜素

5、能顯著地降少順鉑誘導(dǎo)的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中線粒體的損傷。Western blot結(jié)果顯示:順鉑增加耳蝸組織中Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá);大蒜素能顯著地降低耳蝸組織中Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3的表達(dá)，增加Bcl-2的表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示:順鉑誘導(dǎo)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中細(xì)胞色素C的釋放、cleaved-caspas

6、e-9和cleaved-caspase-3的表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)外毛細(xì)胞、支持細(xì)胞中P53的表達(dá)增強(qiáng)，大蒜素能顯著地減少螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中細(xì)胞色素C的釋放，cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3的表達(dá)，減少耳蝸中轉(zhuǎn)、底轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞中P-53的表達(dá)及耳蝸中轉(zhuǎn)支持細(xì)胞中P53的表達(dá)。此外，大蒜素能降低耳蝸組織中丙二醛水平，升高耳蝸組織中超氧化物歧化酶的水平。
　　結(jié)論:大蒜素可有效地預(yù)防順鉑誘導(dǎo)的聽(tīng)力損失，其中

7、大蒜素通過(guò)線粒體途徑保護(hù)順鉑誘導(dǎo)的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的凋亡，通過(guò)p53途徑來(lái)保護(hù)耳蝸外毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的凋亡。同時(shí)大蒜素通過(guò)抗氧化作用保護(hù)順鉑誘導(dǎo)的耳蝸損傷。
　　第二部分 大蒜素通過(guò)抑制凋亡通路減少順鉑誘導(dǎo)的前庭毒性
　　目的:本研究的目的是探討大蒜素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的小鼠前庭功能障礙的保護(hù)，并探討大蒜素對(duì)順鉑誘導(dǎo)的耳前庭毒性的保護(hù)作用機(jī)理。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)所用C57小鼠性別匹配，年齡在7-8周，體重17-23 g。小鼠被

8、隨機(jī)分為三組，每組10只;第1組，0.9％生理鹽水注射為對(duì)照組;第2組，順鉑注射;第3組，順鉑+大蒜素注射。第1組小鼠給予連續(xù)七天腹腔注射0.9％生理鹽水（0.6毫升/100克）。第2組小鼠給予連續(xù)七天腹腔注射順鉑(3毫克/公斤)。第3組小鼠在順鉑注射前一天腹腔注射大蒜素（18.2毫克/公斤），在接下來(lái)的連續(xù)七天先腹腔注射大蒜素，2小時(shí)之后再腹腔注射順鉑（3毫克/公斤），用藥前后都用游泳實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察小鼠的泳姿情況。游泳測(cè)試設(shè)備為盛有溫水的

9、矩形水箱，長(zhǎng)70厘米，寬40厘米，深10厘米，小鼠被放置在水箱的中心和身體與水箱的長(zhǎng)軸平行，放手，觀察小鼠自由游泳的姿勢(shì)。小鼠以穩(wěn)定的姿勢(shì)游泳，頭露出水面，評(píng)分為3分。小鼠頭露出水面，游泳姿勢(shì)不穩(wěn)，評(píng)分為2分。小鼠的頭部不能向上或不能露出水面，評(píng)分為0分，這只小鼠必須立即從水中被救出，以免被淹死。每組隨機(jī)抽取5只小鼠進(jìn)行游泳試驗(yàn)，每只小鼠進(jìn)行3次試驗(yàn)，每次1分鐘，每次間隔10分鐘。交替試驗(yàn)，防止過(guò)度疲勞影響試驗(yàn)結(jié)果。計(jì)算游泳得分平均數(shù)進(jìn)

10、行統(tǒng)計(jì)分析。測(cè)試是在室溫下進(jìn)行的。用免疫熒光方法觀察三組實(shí)驗(yàn)中小鼠橢圓囊、球囊、壺腹毛細(xì)胞纖毛束的外觀和密度。用TUNEL試劑盒檢測(cè)三組實(shí)驗(yàn)中小鼠橢圓囊、球囊、壺腹毛細(xì)胞的凋亡情況。用免疫熒光方法檢測(cè)三組中小鼠橢圓囊、球囊、壺腹毛細(xì)胞層和血管層細(xì)胞質(zhì)中cleaved-caspase-3的表達(dá)情況及熒光密度，用免疫熒光方法檢測(cè)三組實(shí)驗(yàn)中小鼠橢圓囊、球囊、壺腹毛細(xì)胞層和血管層細(xì)胞核中AIF的表達(dá)情況及AIF核轉(zhuǎn)移率。
　　結(jié)果:游泳實(shí)

11、驗(yàn)結(jié)果表明，C57小鼠單獨(dú)腹腔注射順鉑組表現(xiàn)出前庭功能受損，而大蒜素+順鉑組中大蒜素能顯著地保護(hù)小鼠的前庭功能。注射順鉑7天后，順鉑組的橢圓囊、球囊和壺腹毛細(xì)胞的纖毛束數(shù)量明顯減少，纖毛束分布不均和外觀不正常，然而，順鉑+大蒜素組橢圓囊、球囊和壺腹毛細(xì)胞的纖毛束保存較好、外觀正常和高密度分布。TUNEL檢測(cè)凋亡情況:對(duì)照組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)TUNEL染色，在順鉑組的前庭神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、間質(zhì)細(xì)胞、橢圓囊、球囊、壺腹中毛細(xì)胞和支持細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了TUNEL

12、陽(yáng)性染色。然而，在順鉑+大蒜素治療組的前庭神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元、毛細(xì)胞和支持細(xì)胞中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)TUNEL染色，只有一些間質(zhì)細(xì)胞被TUNEL染色標(biāo)記。免疫熒光檢測(cè)cleaved-caspase-3結(jié)果:在對(duì)照組中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)cleaved-caspase-3染色。在順鉑治療組中前庭毛細(xì)胞層和血管層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)cleaved-caspase-3陽(yáng)性染色。在順鉑+大蒜素組中，前庭毛細(xì)胞和血管層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中cleaved-caspase-3的表達(dá)明

13、顯減少。在順鉑組的前庭毛細(xì)胞層和血管層細(xì)胞cleaved-caspase-3的熒光密度明顯高于對(duì)照組，而在順鉑+大蒜素組，大蒜素顯著地降低了前庭毛細(xì)胞層和血管層細(xì)胞cleaved-caspase-3的熒光密度。免疫熒光檢測(cè)AIF的表達(dá)情況:在對(duì)照組中，AIF在前庭毛細(xì)胞層和血管層細(xì)胞質(zhì)中分布，在細(xì)胞核內(nèi)沒(méi)有分布。經(jīng)過(guò)7天的順鉑治療，在前庭毛細(xì)胞層和血管層細(xì)胞的核區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)烈的AIF熒光。前庭毛細(xì)胞層和血管層細(xì)胞中AIF核轉(zhuǎn)移率在順鉑

14、組明顯高于對(duì)照組;在順鉑+大蒜素組，大蒜素顯著地降低毛細(xì)胞層AIF核轉(zhuǎn)移率，但是大蒜素沒(méi)有顯著地降低血管層細(xì)胞AIF核轉(zhuǎn)移率。
　　結(jié)論:腹腔注射順鉑的小鼠，在游泳測(cè)試中表現(xiàn)出前庭功能障礙，這結(jié)果表明小鼠的前庭受損。然而，在大蒜素預(yù)處理組，大蒜素可以明顯地阻止了這些損傷。大蒜素顯著地減少順鉑誘導(dǎo)的橢圓囊、球囊、壺腹的毛細(xì)胞層和血管層細(xì)胞中cleaved-caspase-3的表達(dá)，也減少了橢圓囊、球囊、壺腹的毛細(xì)胞層中AIF的核轉(zhuǎn)位