一個新型細菌單雜交系統(tǒng)報告載體的構建及其在轉錄因子發(fā)現中的應用.pdf

1、蛋白質和核酸是生命體最為重要的兩類生物大分子?；虻谋磉_調控特別是轉錄調控主要體現為蛋白質與DNA分子間特異性的相互作用。因此,發(fā)展有效的DNA.蛋白質相互作用分析技術對于深入理解基因的轉錄調控機制和發(fā)掘新功能基因具有重要意義。
　　 近年來,以生物大分子間親和力為基礎的篩選策略已被廣泛應用于鑒定蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA分子間的相互作用。本課題基于募集RNA聚合酶實現轉錄激活這一基本原理,以商業(yè)化的細菌雙雜交系統(tǒng)誘餌載體p

2、BT為基礎,成功構建了能用于分析蛋白質-DNA相互作用的細菌單雜交(B1H)篩選報告載體pBXcmT,并將其應用于篩選和鑒定與結核分支桿菌毒力基因CFP-10上游調控序列相互作用的潛在轉錄因子。本研究取得了以下幾個方面的研究結果:①以細菌雙雜交系統(tǒng)報告菌株總DNA為模板,PCR擴增獲得了約1.7 kb的His3-aadA報告基因片段,并進行了測序驗證；②將pBT載體中λcⅠ和lac-UV5啟動子切除,末端處理后自連環(huán)化,然后將上面獲得的

3、His3-aadA報告基因片段定向克隆到該載體中構建了初始報告載體pRpb；③為了有效抑制自激活,降低篩選背景,通過構建和篩選部分基因文庫,在pRpb報告基因上游成功引入間隔DNA插入片段,經過進一步酶切位點修飾,獲得了衍生報告載體pRpb-S7;④構建了包含有兩個XcmI位點的媒介DNA片段引入到衍生報告載體pRpb-S7的多克隆位點,成功構建成報告載體pBXcmT,該載體經過XcmI酶切后產生的T-載體可用于目的DNA PCR產物的

4、快速克隆；⑤將結核分支桿菌H37Rv毒力蛋白CFP-10基因上游的調控序列克隆到pBXcmT報告基因His3-aadA上游,產生的重組質粒通過篩選病原菌基因文庫,共獲得了4個與該調控序列存在相互作用的潛在轉錄因子。
　　 因此,本研究基于商業(yè)化載體pBT成功構建了一個新的細菌單雜交報告載體,該載體不僅無自激活背景,而且在多克隆位點引入了方便的PCR產物克隆策略。與pTRG文庫載體配合使用,該系統(tǒng)不僅可以鑒定和發(fā)現新的轉錄因子,而