堿性成纖維生長因子對壓瘡肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用及其機(jī)制探討.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、壓瘡深部組織損傷(Deep Tissue Injury,DTI)是壓瘡中最嚴(yán)重分期,好發(fā)于受壓骨隆突處,是臨床護(hù)理工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)。DTI可有皮膚深部組織肌層損傷,局部持續(xù)受壓時(shí),由于血流灌注受阻、大量自由基產(chǎn)生造成肌細(xì)胞損傷。其早期難以發(fā)現(xiàn),發(fā)生潛匿,極易發(fā)展為難愈性創(chuàng)面。目前壓瘡機(jī)制研究主要集中于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),尚未有針對DTI機(jī)制的體外干預(yù)性研究。堿性成纖維生長因子(bFGF)對多種細(xì)胞損傷效果確切,是一種多能細(xì)胞生長因子。因此建立體外

2、DTI模型,在細(xì)胞水平對bFGF調(diào)控骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)制及其相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行探討,或許能夠深入理解壓瘡深部組織損傷,為其防治提供新策略。
  第一部分:大鼠體外壓瘡深部組織損傷肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建
  目的:
  構(gòu)建體外壓瘡深部組織肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型,為在細(xì)胞水平進(jìn)一步探討壓瘡深部組織的損傷機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
  方法:
  選取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大鼠成肌細(xì)胞,隨機(jī)分為6組即對照組及5個(gè)實(shí)驗(yàn)組。對照組行

3、常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組分別采用過氧化氫濃度50、100、150、200、250μmol/L處理1-4 h后檢測四氮甲基唑藍(lán)(MTT),重點(diǎn)觀察不同氧化應(yīng)激水平作用4h后乳酸脫氧酶(LDH)、肌細(xì)胞Hoechst染色及形態(tài)學(xué)方面的改變。
  結(jié)果:
  1.對照組1h至4 h細(xì)胞存活率為100%,活性無明顯變化。
  2.實(shí)驗(yàn)組過氧化氫在100μmol/L以下時(shí),促進(jìn)大鼠成肌細(xì)胞增殖,當(dāng)濃度高于100μmol/L時(shí),2 h

4、后呈損傷趨勢,4 h時(shí)存活率為20%-75%不等。
  3.隨氧化應(yīng)激程度加重,大鼠成肌細(xì)胞形態(tài)逐漸縮收,細(xì)胞間隙逐漸增加。
  4.100μmol/L過氧化氫作用4 h后,Hoechst細(xì)胞熒光染色顯示部分大鼠肌細(xì)胞趨向凋亡。
  5.大鼠成肌細(xì)胞在100μmol/L過氧化氫作用4h后LDH釋放率相比對照組具有顯著性差異。
  結(jié)論:
  1.隨氧化應(yīng)激程度加重,大鼠成肌細(xì)胞活力下降,細(xì)胞膜通透性增加,胞

5、核漸進(jìn)性凋亡。
  2.大鼠成肌細(xì)胞經(jīng)過氧化氫100μmo l/L作用4 h,可作為壓瘡深部組織細(xì)胞氧化應(yīng)激的體外模型。
  第二部分:bFGF干預(yù)在大鼠體外壓瘡深部組織的肌細(xì)胞損傷中的作用
  目的:
  在大鼠體外DTI氧化應(yīng)激模型基礎(chǔ)上,探討bFGF干預(yù)在大鼠成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用。
  方法:
  進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng),待細(xì)胞生長至指數(shù)增長期后,同時(shí)換液。根據(jù)培養(yǎng)基中有無H2O2及bFGF干

6、預(yù)可分為:正常對照組(Con),單純bFGF組(bFGF),氧化應(yīng)激組(H2O2)及干預(yù)組(bFGF+H2O2)。氧化應(yīng)激組過氧化氫濃度及時(shí)間點(diǎn)的確定參照R.Dhanya及前期體外DTI細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建過程[43,51]的研究方法,干預(yù)組(bFGF+H2O2,bFGF濃度參考Wang等[52,53]的研究),正常對照組不做任何處理。單純bFGF組:提前2 h給予100 ng/ml bFGF。氧化應(yīng)激組:100μmol/L雙氧水培養(yǎng)基

7、處理4 h。干預(yù)組:100 ng/ml bFGF預(yù)給2 h后,按照100μmol/L加入雙氧水繼續(xù)孵育4h。各組分別于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)進(jìn)行多水平檢測。免疫熒光法分析肌細(xì)胞的活性氧自由基、Bax及Cyt C表達(dá)情況;SABC免疫組化法于倒置顯微鏡下觀察Bcl-2與Bax表達(dá)變化;蛋白印跡檢測肌細(xì)胞PARP,PCNA等蛋白表達(dá)趨勢。
  結(jié)果:
  1.氧自由基表達(dá)水平:活性氧自由基檢測結(jié)果顯示氧化應(yīng)激組中大鼠成肌細(xì)胞ROS熒光表達(dá)呈強(qiáng)

8、陽性,細(xì)胞突觸變短,胞質(zhì)明顯回縮。干預(yù)組相較于氧化應(yīng)激組,其氧化應(yīng)激強(qiáng)度顯著下降(P<0.01)。
  2.免疫組化結(jié)果顯示:正常對照組和單純bFGF組大鼠成肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有大量Bcl-2顆粒,少數(shù)細(xì)胞Bax顆粒少量表達(dá);應(yīng)激組Bcl-2陽性顆粒明顯減少,Bax表達(dá)顯著增加;造模前2h給予bFGF干預(yù),可上調(diào)Bcl-2水平,抑制Bax表達(dá)。
  3.間接免疫熒光結(jié)果顯示:正常對照組和單純bFGF組的Bax及Cyt C蛋白

9、熒光較弱。氧化應(yīng)激組Bax熒光表達(dá)呈強(qiáng)陽性,Cyt C滲入胞外,呈彌漫性紅色熒光顆粒。而含有bFGF的干預(yù)組Bax熒光強(qiáng)度明顯減弱,Cyt C仍局限于胞質(zhì),熒光顆粒亮度減弱。
  4.Western blot檢測顯示:正常對照組和單純bFGF組低水平表達(dá)Bax蛋白、Cyt.C及PARP蛋白,PCNA較高水平表達(dá);氧化應(yīng)激組Bax、Cyt.C及PARP蛋白表量明顯增加,細(xì)胞增殖分裂進(jìn)程受阻;干預(yù)組大鼠成肌細(xì)胞Bax蛋白、細(xì)胞Cyt.

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