堿性成纖維生長因子對壓瘡肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用及其機(jī)制探討.pdf

1、壓瘡深部組織損傷（Deep Tissue Injury，DTI）是壓瘡中最嚴(yán)重分期，好發(fā)于受壓骨隆突處，是臨床護(hù)理工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)。DTI可有皮膚深部組織肌層損傷，局部持續(xù)受壓時(shí)，由于血流灌注受阻、大量自由基產(chǎn)生造成肌細(xì)胞損傷。其早期難以發(fā)現(xiàn)，發(fā)生潛匿，極易發(fā)展為難愈性創(chuàng)面。目前壓瘡機(jī)制研究主要集中于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，尚未有針對DTI機(jī)制的體外干預(yù)性研究。堿性成纖維生長因子（bFGF）對多種細(xì)胞損傷效果確切，是一種多能細(xì)胞生長因子。因此建立體外

2、DTI模型，在細(xì)胞水平對bFGF調(diào)控骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)制及其相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行探討，或許能夠深入理解壓瘡深部組織損傷，為其防治提供新策略。
　　第一部分：大鼠體外壓瘡深部組織損傷肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建
　　目的：
　　構(gòu)建體外壓瘡深部組織肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型，為在細(xì)胞水平進(jìn)一步探討壓瘡深部組織的損傷機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　選取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大鼠成肌細(xì)胞，隨機(jī)分為6組即對照組及5個(gè)實(shí)驗(yàn)組。對照組行

3、常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組分別采用過氧化氫濃度50、100、150、200、250μmol/L處理1-4 h后檢測四氮甲基唑藍(lán)（MTT），重點(diǎn)觀察不同氧化應(yīng)激水平作用4h后乳酸脫氧酶（LDH）、肌細(xì)胞Hoechst染色及形態(tài)學(xué)方面的改變。
　　結(jié)果：
　　1.對照組1h至4 h細(xì)胞存活率為100％，活性無明顯變化。
　　2.實(shí)驗(yàn)組過氧化氫在100μmol/L以下時(shí)，促進(jìn)大鼠成肌細(xì)胞增殖，當(dāng)濃度高于100μmol/L時(shí)，2 h

4、后呈損傷趨勢，4 h時(shí)存活率為20%-75%不等。
　　3.隨氧化應(yīng)激程度加重，大鼠成肌細(xì)胞形態(tài)逐漸縮收，細(xì)胞間隙逐漸增加。
　　4.100μmol/L過氧化氫作用4 h后，Hoechst細(xì)胞熒光染色顯示部分大鼠肌細(xì)胞趨向凋亡。
　　5.大鼠成肌細(xì)胞在100μmol/L過氧化氫作用4h后LDH釋放率相比對照組具有顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　1.隨氧化應(yīng)激程度加重，大鼠成肌細(xì)胞活力下降，細(xì)胞膜通透性增加，胞

5、核漸進(jìn)性凋亡。
　　2.大鼠成肌細(xì)胞經(jīng)過氧化氫100μmo l/L作用4 h，可作為壓瘡深部組織細(xì)胞氧化應(yīng)激的體外模型。
　　第二部分：bFGF干預(yù)在大鼠體外壓瘡深部組織的肌細(xì)胞損傷中的作用
　　目的：
　　在大鼠體外DTI氧化應(yīng)激模型基礎(chǔ)上，探討bFGF干預(yù)在大鼠成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用。
　　方法：
　　進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至指數(shù)增長期后，同時(shí)換液。根據(jù)培養(yǎng)基中有無H2O2及bFGF干

6、預(yù)可分為：正常對照組（Con），單純bFGF組（bFGF），氧化應(yīng)激組(H2O2)及干預(yù)組(bFGF+H2O2)。氧化應(yīng)激組過氧化氫濃度及時(shí)間點(diǎn)的確定參照R．Dhanya及前期體外DTI細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建過程[43，51]的研究方法，干預(yù)組(bFGF+H2O2，bFGF濃度參考Wang等[52,53]的研究)，正常對照組不做任何處理。單純bFGF組：提前2 h給予100 ng/ml bFGF。氧化應(yīng)激組：100μmol/L雙氧水培養(yǎng)基

7、處理4 h。干預(yù)組：100 ng/ml bFGF預(yù)給2 h后，按照100μmol/L加入雙氧水繼續(xù)孵育4h。各組分別于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)進(jìn)行多水平檢測。免疫熒光法分析肌細(xì)胞的活性氧自由基、Bax及Cyt C表達(dá)情況；SABC免疫組化法于倒置顯微鏡下觀察Bcl-2與Bax表達(dá)變化；蛋白印跡檢測肌細(xì)胞PARP,PCNA等蛋白表達(dá)趨勢。
　　結(jié)果：
　　1.氧自由基表達(dá)水平：活性氧自由基檢測結(jié)果顯示氧化應(yīng)激組中大鼠成肌細(xì)胞ROS熒光表達(dá)呈強(qiáng)

8、陽性，細(xì)胞突觸變短，胞質(zhì)明顯回縮。干預(yù)組相較于氧化應(yīng)激組，其氧化應(yīng)激強(qiáng)度顯著下降(P＜0.01)。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示：正常對照組和單純bFGF組大鼠成肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有大量Bcl-2顆粒，少數(shù)細(xì)胞Bax顆粒少量表達(dá)；應(yīng)激組Bcl-2陽性顆粒明顯減少，Bax表達(dá)顯著增加；造模前2h給予bFGF干預(yù)，可上調(diào)Bcl-2水平，抑制Bax表達(dá)。
　　3.間接免疫熒光結(jié)果顯示：正常對照組和單純bFGF組的Bax及Cyt C蛋白

9、熒光較弱。氧化應(yīng)激組Bax熒光表達(dá)呈強(qiáng)陽性，Cyt C滲入胞外，呈彌漫性紅色熒光顆粒。而含有bFGF的干預(yù)組Bax熒光強(qiáng)度明顯減弱，Cyt C仍局限于胞質(zhì)，熒光顆粒亮度減弱。
　　4.Western blot檢測顯示：正常對照組和單純bFGF組低水平表達(dá)Bax蛋白、Cyt.C及PARP蛋白，PCNA較高水平表達(dá)；氧化應(yīng)激組Bax、Cyt.C及PARP蛋白表量明顯增加，細(xì)胞增殖分裂進(jìn)程受阻；干預(yù)組大鼠成肌細(xì)胞Bax蛋白、細(xì)胞Cyt.