絲狀真菌纖維素酶農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的構(gòu)建及其在纖維素酶學研究中的應用.pdf

1、隨著不可再生的化石能源的不斷消耗，現(xiàn)有的以石油和煤炭為基礎的傳統(tǒng)能源將會逐漸枯竭。世界各國家為了保障自身能源供應，確保本國經(jīng)濟健康發(fā)展，先后著手尋找替代能源尤其是可再生性能源。纖維素是地球上最豐富的可再生性資源，占地球總生物量的40﹪，如果能將這種產(chǎn)量巨大的可再生性資源轉(zhuǎn)化為人類急需的能源、食物和化工原料，對于人類社會的可持續(xù)性發(fā)展具有非常重要的意義?，F(xiàn)在纖維素降解的方法有很多，常用的酸或高溫處理的方法雖然也能降解纖維素，但同時會產(chǎn)生很

2、多難以接受的副產(chǎn)物，污染環(huán)境，并使葡萄糖受到破壞。于是人們把目光逐漸轉(zhuǎn)移到纖維素的酶解，但目前纖維素酶對纖維素的降解效率太低，成為大規(guī)模推廣使用的制約因素。為了解決這個問題，基因工程和蛋白質(zhì)工程手段被應用到纖維素酶改造上來。以便解決目前困擾纖維素生物降解的關鍵問題：即研究清楚纖維素酶降解機制。 隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程手段被應用到纖維素酶改造上來，另一個問題也隨之凸現(xiàn)出來，即目前還沒有找到適合纖維素酶的表達系。所以構(gòu)建合適的纖維

3、素酶表達系統(tǒng)也隨之成為束縛纖維素酶研究的瓶頸。目前研究資料表明，纖維素酶在大腸肝菌表達系中易形成包涵體、表達的酶活性比較低以及缺乏糖基化修飾等，這些問題使得大腸桿菌不能成為絲狀真菌纖維素酶的理想表達系。而在酵母中表達又由于存在著過度的糖基化和蛋白折疊問題，使表達的纖維素酶活性喪失嚴重，基本失去研究和應用價值。絲狀真菌瑞氏木霉是在纖維素酶學研究和纖維素酶應用中最為廣泛采用的纖維素酶高產(chǎn)菌，但是傳統(tǒng)的以潮霉素為代表的絲狀真菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法

4、由于轉(zhuǎn)化效率太低，加之絲狀真菌表達的為混合酶系，分離純化目的蛋白比較困難。這些缺點都直接限制了絲狀真菌作為纖維素酶表達宿主。 基于上述存在的問題，本文嘗試從構(gòu)建農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化絲狀真菌入手，著手構(gòu)建起一套適合于纖維素酶學研究的絲狀真菌表達系統(tǒng)。 在成功構(gòu)建該絲狀真菌表達系統(tǒng)的基礎上，開展了兩個方面的工作。一是構(gòu)建了瑞氏木霉外切纖維素酶Ⅰ(CBHⅠ)在粗糙脈孢菌組成型表達的表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)在含有葡萄糖的培養(yǎng)條件下，可以抑制宿

5、主本身纖維素酶的分泌，僅表達外源目的外切纖維素酶 CBHI。這一工作為今后開展單一纖維素酶學研究和為今后構(gòu)建高酶活的纖維素酶生產(chǎn)菌建立了技術基礎。二是利用這一系統(tǒng)，和美國愛荷華州州立大學Chandrika Mulakala博士合作開展了纖維素酶CBH I的吸附結(jié)構(gòu)域和纖維素相互作用模式的研究。在美國愛荷華州州立大學Chandrika Mulakala博士的幫助下利用Swiss-pdb vkewer,PyMol等生物信息軟件分析了CBH

6、I的纖維素吸附結(jié)構(gòu)域并在其幫助下分析了她提出的纖維素酶CBH I在生物降解過程中的作用模式。經(jīng)過分析得到了幾個潛在的影響吸附結(jié)構(gòu)域跟纖維素結(jié)合的氨基酸位點。借助于體外點突變技術對相應的位點進行了點突變。并將這些點突變的基因構(gòu)建到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒中。利用已經(jīng)建立的起來的轉(zhuǎn)化方法將其中兩個點突變了的基因轉(zhuǎn)化到了粗糙脈孢菌中，并得到了組成型的表達。經(jīng)過初步的酶學分析，實驗結(jié)果還不能很好的支持Mulakala 博士提出的吸附結(jié)構(gòu)域糙面剝離假說，但