電針通過神經(jīng)元α7nAChR調(diào)控炎癥小體減輕腦缺血后神經(jīng)炎癥的作用及其機制.pdf

1、缺血性腦卒中是導致患者神經(jīng)功能障礙及肢體癱瘓的重要原因之一。盡管重組組織型纖溶酶原激活物(r-tPA)是一種有效的治療方式,由于治療時間窗較窄，只有3-5％病人能夠接受并可能從中受益。電針腦保護策略是我科提出的預防圍術期腦缺血損傷的新策略，電針可以減輕動物MCAO后神經(jīng)功能缺失及減少梗死面積。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，電針可增加缺血再灌注后腦內(nèi)內(nèi)源性大麻素AEA和2-AG含量，同時上調(diào)CB1R，調(diào)控RISK通路中（ERK、εPKC、GSK-3β

2、、STAT3等功能分子的磷酸化水平）、抑制神經(jīng)細胞凋亡，從而發(fā)揮腦保護作用。此外，我們發(fā)現(xiàn)電針可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元膽堿能抗炎通路中α7nAChR抑制HMGB1釋放減輕腦缺血后神經(jīng)炎癥。
　　NLRP3炎癥小體作為觸發(fā)炎癥反應的整合平臺，主要由NLRP3、ASC和caspase1前體組成。當各種危險信號作用于細胞膜上TLRs受體后，激活了細胞內(nèi)NF-κB通路，促進炎癥小體蛋白和IL-1β、IL-18前體的合成；細胞內(nèi)各種DAMPs刺激

3、活化NLRP3炎癥小體，切割活化procaspase1并促進IL-1β、IL-18成熟和釋放，發(fā)揮促炎作用。此外，caspase1通過一種特殊的方式激活了細胞凋亡，導致神經(jīng)元和膠質細胞的死亡。綜上所述，NLRP3炎癥小體在啟動固有免疫反應，caspase1活化以及腦缺血后神經(jīng)系統(tǒng)無菌性炎癥反應中均發(fā)揮重要作用。
　　因此，本實驗旨在探索電針是否通過神經(jīng)元α7nAChR調(diào)控炎癥小體減輕腦缺血后神經(jīng)炎癥的作用及其機制，為電針腦保護作用

4、提供了更多實驗依據(jù)，并為電針向臨床應用轉化提供了堅實的理論基礎。
　　實驗一腦缺血再灌注損傷對炎癥小體表達的影響
　　目的:
　　觀察腦缺血再灌注損傷后不同時間點炎癥小體表達的變化。
　　方法:
　　雄性SD大鼠20只，隨機分為假手術Sham組(n=4)、MCAO組(n=16)。其中MCAO組再隨機分為四組(n=4)，行大腦中動脈阻塞模型1.5小時后，分別于再灌注后的6h、24h、3d、7d處死，取同側半暗

5、帶皮層組織，Western Blot檢測炎癥小體蛋白NLRP3、Cl.Caspase1和Mature IL-1β的變化。
　　結果:
　　與Sham組相比，NLRP3在MCAO后24h、3d、7d表達明顯增高(P<0.01)，Cl.Caspase1在MCAO后3d、7d表達增高(P<0.01)，Mature IL-1β含量在MCAO后6h、24h、3d、7d表達均明顯增高(P<0.01)。
　　結論:
　　腦缺血

6、再灌注損傷后不同時間點炎癥小體表達逐漸升高，其中腦缺血再灌注后3d炎癥小體表達量最高，因此我們選擇3d這個時間點進行電針干預。
　　實驗二電針對腦缺血再灌注后NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應的影響
　　目的:
　　1.證實電針抑制了腦缺血再灌注后NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應。
　　2.探索電針是否調(diào)節(jié)了腦缺血再灌注后缺血半暗帶區(qū)促炎因子和抗炎因子表達平衡。
　　方法:
　　1.電針是否抑制腦缺血再

7、灌注后NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應
　　雄性 SD大鼠21只，隨機分為假手術 Sham組(n=7)、MCAO3d組(n=7)及電針EA+MCAO3d組(n=7)。其中MCAO3d組及EA+MCAO3d組，行大腦中動脈阻塞模型1.5小時后，分別于再灌注后3d取材。Western Blot檢測炎癥小體蛋白 NLRP3、Cl.Caspase1和Mature IL-1β的變化；免疫熒光染色檢測NLRP3和Caspase1表達變化情況。

8、
　　2.電針是否調(diào)節(jié)腦缺血再灌注后缺血半暗帶區(qū)促炎因子和抗炎因子表達的平衡
　　雄性 SD大鼠24只，隨機分為假手術 Sham組(n=8)、MCAO3d組(n=8)及電針EA+MCAO3d組(n=8)。ELISA試劑盒檢測促炎因子IL-18、TNF-α和抑炎因子TGF-β1、IL-10表達含量的變化。
　　結果:
　　1.與MCAO3d組相比，電針降低了腦缺血再灌注后NLRP3、Cl.Caspase1和Matu

9、re IL-1β表達含量(P<0.01)；作為Westernblot的佐證，免疫熒光染色同樣證實了電針降低了腦缺血再灌注后神經(jīng)元中NLRP3和Caspase1免疫熒光強度。
　　2.相比于MCAO3d組，電針降低了腦缺血再灌注后促炎因子IL-18和TNF-α表達含量(P<0.05)，同時升高了抗炎因子TGF-β1和IL-10表達含量(P<0.01)。
　　結論:
　　電針不僅抑制了腦缺血后NLRP3炎癥小體介導的炎癥反

10、應，同時，調(diào)節(jié)了腦缺血后缺血半暗帶區(qū)促炎因子和抗炎因子表達的平衡。
　　實驗三α7nAChR參與電針對NLRP3炎癥小體的抑制并發(fā)揮腦保護作用
　　目的:
　　證實α7nAChR參與電針對NLRP3炎癥小體的抑制并發(fā)揮腦保護作用。
　　方法:
　　雄性SD大鼠112只，隨機分為假手術Sham組、MCAO組、電針EA+MCAO組、α7nAChR的抑制劑α-BGT組、α-BGT溶劑組、α7nAChR的激動劑PH

11、A-543,613組、PHA-543,613溶劑組(n=16)。腦缺血再灌注后3d，取半暗帶組織Western Blot檢測神經(jīng)元中α7nAChR表達含量和炎癥小體蛋白NLRP3，Cl.Caspase1和Mature IL-1β的表達變化(n=4)，3d后評估神經(jīng)行為學及腦梗死體積的大小(n=8)，以及使用TUNEL染色觀察凋亡陽性細胞數(shù)目(n=4)。
　　結果:
　　1.與MCAO3d組相比，電針上調(diào)了腦缺血再灌注后α7n

12、AChR表達含量(P<0.01)。
　　2.與EA+MCAO組相比，EA+α-BGT組上調(diào)了炎癥小體蛋白NLRP3、Cl.Caspase1和Mature IL-1β的表達(P<0.01)；同時，EA+α-BGT組腦梗死體積百分比增加(Ρ<0.05)，神經(jīng)行為學評分降低(P<0.01)，而且TUNEL染色凋亡陽性細胞數(shù)目明顯增加(Ρ<0.05)。
　　3.與MCAO組相比，PHA-543,613不僅可降低腦梗死體積百分比(P<

13、0.01)，改善神經(jīng)行為學評分(P<0.01)，而且減少TUNEL染色凋亡陽性細胞數(shù)目(Ρ<0.01)；同時，PHA-543,613組下調(diào)了炎癥小體蛋白NLRP3、Cl.Caspase1和Mature IL-1β的表達(P<0.05)。
　　結論:
　　1.電針增加了腦缺血再灌注后α7nAChR表達含量。
　　2.給予α7nAChR抑制劑α-BGT干預，可逆轉電針對NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應的抑制；同時α-BGT

14、逆轉了電針的腦保護作用。
　　3.應用α7nAChR的激動劑PHA-543,613干預，可誘導與電針相似的保護作用；同時，PHA-543,613抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應。
　　綜上所述，α7nAChR參與電針對NLRP3炎癥小體的抑制并發(fā)揮腦保護作用。
　　小結:
　　本實驗采用雄性SD大鼠MCAO模型，首先通過western-blot證實了腦缺血后不同時間點炎癥小體表達逐漸升高，其中腦缺血后3d炎癥

15、小體表達量最高。隨后，選擇3d這個時間點進行電針干預，發(fā)現(xiàn)電針抑制了腦缺血后 NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應，同時調(diào)節(jié)了腦缺血后缺血半暗帶區(qū)促炎因子和抗炎因子表達平衡。那么，電針抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應的機制是什么呢？針對這一問題，進一步實驗選擇了α7nAChR抑制劑α-BGT和激動劑PHA-543,613進行干預，證實了α7nAChR參與電針對NLRP3炎癥小體的抑制并發(fā)揮腦保護作用?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)電針通過神經(jīng)元α7n