可溶性PD-L1分子對(duì)T淋巴細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制.pdf

1、協(xié)同刺激信號(hào)在T淋巴細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答過程不同階段發(fā)揮重要的調(diào)控作用。程序性死亡受體1（Programmed death-1，PD-1）是B7家族成員之一，而程序性死亡配體1（Programmed death ligand-1，PD-L1）為協(xié)同刺激分子PD-1的配體之一。PD-1主要表達(dá)于活化的T、B、單核細(xì)胞表面。PD-1/PD-L1介導(dǎo)的負(fù)性抑制信號(hào)可通過抑制T、B淋巴細(xì)胞功能參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，許多協(xié)同刺激分子除

2、以細(xì)胞膜型外，還有可溶性形式存在，如 CD28、CTLA-4（細(xì)胞毒 T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4）、CD80、CD86、B7-H3和 B7-H4等，這些可溶性因子的生物學(xué)意義及與臨床疾病的相關(guān)性尚待研究。通過研究PD-1/sPD-L1途徑對(duì)T淋巴細(xì)胞功能的影響，并闡明其作用機(jī)理，有望為人類疾病的免疫治療提供新策略。
　　本研究通過觀察不同濃度sPD-L1對(duì)人T淋巴細(xì)胞功能的影響及 PD-1胞漿區(qū)信號(hào)接頭分子酪氨酸蛋白酶（SHP）-1、

3、SHP-2及磷酸化SHP-1（p-SHP-1）、p-SHP-2的改變，并分析其生物學(xué)意義，揭示PD-1/sPD-L1協(xié)同刺激信號(hào)對(duì)T淋巴細(xì)胞的抑制機(jī)理，進(jìn)一步探究sPD-L1如何起負(fù)性調(diào)控作用。
　　一、可溶性PD-L1通過PD-1/sPD-L1途徑抑制T淋巴細(xì)胞功能
　　【目的】分析sPD-L1對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響。
　　【方法】應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測定健康人外周血T淋巴細(xì)胞膜表面活化前后的PD-1分子的表達(dá)

4、，應(yīng)用CCK-8法體外研究不同濃度sPD-L1對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響，確定抑制T淋巴細(xì)胞增殖的最低濃度，并流式細(xì)胞術(shù)測定此濃度sPD-L1對(duì)T淋巴細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　【結(jié)果】健康人外周血T淋巴細(xì)胞低表達(dá)PD-1，活化的T淋巴細(xì)胞表面則高表達(dá)PD-1，可溶性PD-L1蛋白（sPD-L1Ig）工作濃度為250 ng/ml時(shí)能通過PD-1/sPD-L1途徑抑制T淋巴細(xì)胞的增殖（P=0.017），低于此濃度的sPD-L1Ig均未能

5、引起T淋巴細(xì)胞增殖的抑制（P>0.05），特異性阻斷PD-1/sPD-L1抑制信號(hào)可部分恢復(fù)T淋巴細(xì)胞的增殖活性（P=0.035）；sPD-L1Ig促使細(xì)胞周期G1期T淋巴細(xì)胞百分比明顯增高（P=0.000），特異性阻斷該抑制信號(hào)可降低G1期T淋巴細(xì)胞百分比（P=0.014）；sPD-L1使 T淋巴細(xì)胞凋亡率明顯增高（P=0.001），加入阻斷劑后可部分逆轉(zhuǎn) T淋巴細(xì)胞的凋亡率（P=0.002）。
　　【結(jié)論】可溶性PD-L1可通

6、過PD-1/sPD-L1途徑抑制活化T淋巴細(xì)胞的增殖，促使細(xì)胞周期停滯在G1期，促進(jìn)其凋亡，sPD-L1表達(dá)的增高，可能與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)。
　　二、PD-1/sPD-L1信號(hào)通路接頭分子SHP-1、SHP-2在對(duì)T淋巴細(xì)胞功能抑制作用中的意義
　　【目的】檢測不同年齡段健康人血清中sPD-L1表達(dá)水平及sPD-L1作用下PD-1接頭分子蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP）-1和 SHP-2的募集量，探討 sPD-L1激發(fā)PD-L

7、1/sPD-1信號(hào)通路抑制信號(hào)的機(jī)制。
　　【方法】選取2013年6月至2014年5月于蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院體檢中心健康志愿者108例，采用酶聯(lián)免疫吸附方法檢測20-30歲，31-50歲，51-70歲年齡組人群血清中sPD-L1表達(dá)水平。免疫磁珠法分離健康人外周血T淋巴細(xì)胞，將細(xì)胞分為5組：A組：靜止T淋巴細(xì)胞組、B組：活化T淋巴細(xì)胞組、C組：活化T淋巴細(xì)胞+sPD-L1Ig組、D組：活化T淋巴細(xì)胞+sPD-L1Ig+mIgG組、

8、E組：活化T淋巴細(xì)胞+sPD-L1Ig+2H11組。免疫沉淀法沉積PD-1接頭分子SHP-1和SHP-2，Western印跡法檢測各組細(xì)胞SHP-1，p-SHP-1，SHP-2，p-SHP-2分子表達(dá)量。
　　【結(jié)果】健康人外周血中存在sPD-L1分子表達(dá)，20-30歲年齡組的表達(dá)水平最低，其濃度約為（0.766±0.154）ng/ml，31-50歲組表達(dá)水平為（0.866±0.201）ng/ml，51-70歲年齡組則具有更高表達(dá)

9、水平（1.047±0.453）ng/ml。20-30歲組與31-50歲組、51-70歲組、31-50歲組與51-70歲組sPD-L1分子表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000；P=0.000；P=0.001）。根據(jù)第一部分細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果，sPD-L1仍采用250 ng/ml工作濃度，并按前述細(xì)胞處理方法進(jìn)行分組，各組細(xì)胞SHP-1、SHP-2的表達(dá)量（灰度值）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；C組p-SHP-1、p-SHP-2表達(dá)

10、量均顯著高于B組（P=0.000；P=0.000）；E組p-SHP-1表達(dá)量顯著低于D組（P=0.028）。
　　【結(jié)論】健康人外周血中 sPD-L1中表達(dá)水平與年齡有關(guān)；加入 sPD-L1后p-SHP-1、p-SHP-2表達(dá)量均顯著高于未加入sPD-L1組，可能與PD-1/sPD-L1抑制途徑有關(guān)。特異性阻斷 PD-1/sPD-L1抑制途徑抑制信號(hào)可部分恢復(fù) p-SHP-1功能，p-SHP-1在PD-1/sPD-L1抑制途徑中起

11、重要作用。
　　綜上所述，本課題研究獲得了以下研究結(jié)果：（1）sPD-L1Ig能抑制 T淋巴細(xì)胞的增殖，使T淋巴細(xì)胞周期停滯在G1期，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞凋亡。通過PD-L1阻斷型單抗可部分恢復(fù)T淋巴細(xì)胞的功能。提示sPD-L1是通過與T淋巴細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合而產(chǎn)生負(fù)性免疫調(diào)控作用。（2）健康人外周血中sPD-L1表達(dá)水平與年齡有關(guān)；sPD-L1促進(jìn)PD-1接頭分子p-SHP-1、p-SHP-2的表達(dá)，特異性阻斷PD-L1可部分恢復(fù)