人qki基因啟動子克隆及TNF對qki基因轉錄調控的初步研究.pdf

1、QKI是屬于STAR（signal transduction and activation of RNA）家族的一種RNA結合蛋白，在進化過程中高度保守，在神經系統(tǒng)發(fā)育過程中參與髓鞘發(fā)育，及胚胎發(fā)育中的心血管系統(tǒng)發(fā)育。Qki基因不同部位的突變體小鼠可以表現(xiàn)在出生前死于心血管肌肉系統(tǒng)發(fā)育障礙，或于出生后10 天表現(xiàn)為快速的震顫以及到了成年強直性驚厥的發(fā)作 。 Qki 基因長度大約為65kb ,含有9 個外顯子,通過不同的剪接可以

2、產生至少5 個轉錄子Kondo(1999) 發(fā)現(xiàn)含量較高的是5kb (qkI-5) 、6kb (qkI-6)和7kb ( qkI-7) , 分別編碼產生QKI-5 、QKI-6 和QKI-7 三種蛋白質。它們擁有共同的KH 結構域及其兩側的QUA1 和QUA2 結構域,但羧基端和3’非翻譯區(qū)各不相同。其中QKI-5 主要定位于胞核中，QKI-6，QKI-7 主要定位于胞漿中。 Pilotte 等發(fā)現(xiàn)QKI-7 可以引起成纖維細

3、胞和原代培養(yǎng)的大鼠少突膠質細胞發(fā)生凋亡,它的致凋亡序列是位于羧基末端的14 個氨基酸殘基,QKI-5 和QKI-6 不但不能誘導凋亡,反而可以與QKI-7 形成二聚體,并轉移到細胞核內,抑制QKI-7 的致凋亡作用[7] 。另外許多有關QKI的功能研究大都集中在神經系統(tǒng)，特別是與髓鞘發(fā)育相關的分子機理方面。 NFKappaB 作為一種氧化還原敏感的轉錄因子在胚胎的發(fā)育過程中發(fā)揮著關鍵的作用，并且可以調節(jié)許多與炎癥有關的基因的表

4、達。 NFKappaB 的激活可以通過促進一些基因的表達來啟動炎癥的發(fā)生，這些基因包括細胞因子，白細胞黏附分子以及化學趨化因子等基因。 因此NFKappaB 在一些與炎癥有關疾病的發(fā)生發(fā)展過程中有著重要的作用，其中包括動脈粥樣硬化，炎癥性腸病，自身免疫性關節(jié)炎，腎小球腎炎，敗血性休克，腫瘤的發(fā)生等等。另一方面，qki 基因特定部位的突變會導致胚胎心血管系統(tǒng)嚴重的發(fā)育障礙。其次，對qki 基因啟動子區(qū)進行分析，具有NF

5、KappaB 的結合位點。最后，通過生物信息學預測，QKI 作為一種RNA 結合蛋白，有一些與炎癥有關的靶分子，如VCAM ，COX-2 等等。但有關QKI 參與心血管發(fā)育及炎癥發(fā)生發(fā)展過程中的分子機理，具體的還完全不清楚。 為了進一步研究在心血管發(fā)育及炎癥發(fā)生發(fā)展過程中，qki在外界不同信號刺激下表達水平的變化，首先我們構建了qki基因啟動子的熒光報告系統(tǒng)，并構建了不同的啟動子截短體，從啟動子水平證實了炎癥刺激因子TNF對q

6、ki的調控作用，其次通過RT-PCR初步探索了qki在TNF刺激下的轉錄水平的變化。最后表達并純化了6×His -QKI-7 融合蛋白，制備了高特異性的多克隆抗體 。由于QKI不同的剪接體之間有90％以上的氨基酸同源序列，有幾乎相同的抗原表位，因此利用6×His-QKI-7 融合蛋白所制備的多克隆抗體可以識別QKI不同的剪接體，其實是針對各種QKI蛋白的多克隆抗體 。我們利用所制備的QKI蛋白的多克隆抗體同樣檢測了TNF刺激下的qki基

7、因表達水平的變化。此外，我們還比較了利用三種不同的免疫佐劑制備QKI多克隆抗體的效果 。 主要研究結果包括： 1．首先我們克隆了qki 基因翻譯起始位點ATG 上游序列并構建熒光報告系統(tǒng)，通過檢測熒光素酶的活性證明該報告系統(tǒng)有啟動子活性。 通過NCBI 基因組數據庫查找到基因ATG 上游約2165bp 序列，利用PCR 技術擴增該片斷，將其克隆到pGL3-BasicVector 中，插入到熒光素酶報告基因上

8、游多克隆結合位點處，這樣當檢測到熒光素酶報告基因的表達，就說明克隆的片斷存在啟動子序列或轉錄調控序列。 我們將構建的啟動子區(qū)熒光報告系統(tǒng)(QP-luc，pBind）轉入Hy906和293 細胞中，顯示熒光素酶的表達，說明克隆的qki 基因ATG 上游序列含啟動子活性。通過TNF 和其下游NFKappaB 的活性亞單位P65刺激可以使啟動子活性降低，用IkappaB mutant form 可以阻斷TNF對QKI 基因啟動子活性

9、的下調作用。 2．將克隆的啟動子區(qū)依照所預測的NFKappaB 結合位點依次截短，構建分別包含3，2，1 個NFKappaB 結合位點的qki 啟動子截短體，通過TNF 及其相關信號途徑分子的刺激和阻斷進行啟動子活性的分析。 對克隆的約2kb 片段進行啟動子區(qū)預測，發(fā)現(xiàn)四個可能的NFKappaB 結合位點。因此，構建qki 基因啟動子區(qū)3 個5’端缺失體熒光報告載體QP3（1652bp，預測含有3 個NFKappaB

10、 結合位點）、QP2（1083 bp，預測含有2 個NFKappaB 結合位點）、QP1（968 bp，預測含有1 個NFKappaB 結合位點）。將構建的各啟動子熒光報告系統(tǒng)轉入真核細胞中，結果顯示三個截短體熒光素酶表達在TNF 和其下游NFKappaB 的活性亞單位P65 刺激下均有降低，QP4 和QP1 用IkappaB mutant form 可以阻斷TNF 對qki 基因啟動子活性的下調作用。 提示克隆的最短序列QP

11、1（968 bp，計算機分析證實該序列中含有一個NFKappaB 結合位點）可能是含有活性NFKappaB 結合位點qki 基因啟動子的最短區(qū)域。 3．通過RT-PCR 檢測TNF 作用下不同時間點qki 基因的轉錄水平的變化，結果提示TNF 作用24 小時內qki 基因的轉錄水平呈先降低后升高的趨勢。 4．通過western-blot 檢測TNF 作用下不同時間點qki 基因的表達水平的變化，結果提示TNF 作用1

12、6 小時內qki 基因的表達水平呈逐漸降低的趨勢。 5．QKI 的原核表達純化和多克隆抗體的制備。將已成功插入QKI-7編碼區(qū)cDNA 并測序正確的PET32b(+)原核表達載體用熱休克法轉化BL21(DE3) 感受態(tài)細胞細菌，以IPTG 誘導6×His-QKI-7 融合蛋白的表達，分別經金屬鰲合柱，反向柱和強陰離子交換柱層析純化。經SDS-PAGE 、Western blot 鑒定后，應用純化的融合蛋白，分別以弗氏佐劑，聚丙

13、烯酰胺凝膠，NC 膜作為佐劑免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。由于QKI 不同的剪接體之間有90％以上的氨基酸同源序列，有幾乎相同的抗原表位，因此利用6×His -QKI-7 融合蛋白所制備的多克隆抗體可以識別QKI 不同的剪接體，其實是針對各種QKI 蛋白的多克隆抗體。Western blot 鑒定抗體的效價和特異性。綜上所述本研究通過構建qki 啟動子區(qū)熒光報告系統(tǒng)并通過熒光素酶檢測及RT-PCR，Western blot 初步確定T