大腸桿菌K12 GlcNAc-1-P尿苷轉移酶的研究.pdf

1、以寡糖和糖復合物(糖脂、糖蛋白等)形式存在的糖類化合物是發(fā)現(xiàn)于所有生命體的重要生物聚合物，它們在眾多復雜生物過程中發(fā)揮著不可替代的重要作用。糖鏈結構形式的特定改變與特定的病理狀態(tài)(如癌癥和炎癥)機密相關，這顯示了糖鏈在臨床診斷中的應用潛力，以及作為藥物開發(fā)靶點的可能性。
　　 自然界中糖鏈的生物合成是由糖基轉移酶催化進行的，它們將相應的糖核苷酸上特定的單糖轉移到一個糖基受體的特定羥基基團上，形成糖苷鍵的共價連接。由于其在高效合成

2、高度空間特異性和立體化學特異性的糖苷鍵方面展現(xiàn)出的優(yōu)勢，利用糖基轉移酶催化糖鏈合成已經(jīng)成為利用有機化學手段合成糖鏈的有效替代途徑。有機合成手段可以為天然化合物提供多樣性的衍生物，為藥物丌發(fā)研究提供更多選擇性靶點。將生物酶法和化學法結合的化學-酶法合成，是近年來廣泛應用于糖生物學研究領域的一個重要手段，有機合成和生物酶法優(yōu)勢互補,成為目前糖生物學和糖化學研究領域的一個充滿生機活力的研究方法和手段。
　　 糖核苷酸(nucleoti

3、de sugars)亦稱為活性糖(active sugars)，在化學結構上是單糖的還原端和核苷一磷酸或二磷酸的末端磷酸基團結合形成的化合物。糖核苷酸的生理意義主要包括:1.通過糖核苷酸之間的相互轉化，產(chǎn)生一系列糖基轉移酶催化反應所必須的活性糖;2.在糖苷和多糖的生物合成過程中，作為糖的供體，是糖單元合成的前體。
　　 UDP-GlcNAc是細胞內(nèi)的一種重要的氨基糖供體，是細胞內(nèi)多種細胞分子合成的前體物質(zhì)。這些細胞內(nèi)分子主要包括

4、細胞壁肽聚糖、脂多糖、腸桿菌科細菌表面共同抗原、幾丁寡糖、GPI錨、糖胺聚糖和糖蛋白等。
　　 生物體內(nèi)UDP-G1cNAc的合成，都以己糖代謝途徑的中間產(chǎn)物果糖-6-磷酸(Fructose-6-P)為起始底物，在多種酶的協(xié)同催化作用下，最終合成UDP-GlcNAc。根據(jù)合成過程中催化反應的順序及合成途徑所涉及酶的來源不同，分為真核UDP-GlcNAc合成途徑和原核UDP-G1cNAc合成途徑。兩種合成途徑的主要區(qū)別在于氨基葡萄

5、糖-6-磷酸(GlcN-6-P)的乙?；彤悩嫽磻南群箜樞虿煌Ｕ婧撕铣赏緩街?，G1cN-6-P先在乙酰轉移酶的作用下，生成乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸(G1cNAc-6-P)，然后再由異構酶作用，生成乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸(GlcNAc-1-P);而原核合成途徑中，G1cN-6-P先異構化為氨基葡萄糖-1-磷酸(G1cN-1-P)，然后再在乙酰轉移酶催化下生成G1cNAc-1-P。
　　 本論文以大腸桿菌K12來源的GlmU

6、為研究對象，對GlmU和GlmU的N-端結構域GlmU-Tr229的底物廣泛性進行了系統(tǒng)研究。除了以揭示它們的底物適應性、酶的動力學性質(zhì)和催化機理為目的的生化研究，本論文還通過體外小量合成反應驗證了GlmU在氨基糖核苷酸合成中的潛在應用價值;本論文還就GlmU突變體進行了初步研究，取得了一定的成果。
　　 論文第二章我們克隆了來自Escherichia coli K12的GlcNAc-1-P尿苷轉移酶(GlmU)，IPTG誘導G

7、lmU蛋白在E.coli BL21(DE3)中表達，帶有N-端His標簽的GlmU蛋白經(jīng)過Ni-NTA純化，SDS-PAGE電泳結果顯示，GlmU純度達到90％以上，GlmU單體分子的表觀分子量約為50 kDa，與理論推導值基本一致。
　　 論文研究了底物GlcNAc-1-P的C2位化學修飾對GlmU催化反應的影響。
　　 分別使用了C2位是羥基(Glc)，C2位為乙酰氨基(GlcNAc)和C2位為有疊氮基修飾(GlcN

8、AcZ)的三種不同糖-1-磷酸衍生物。實驗結果發(fā)現(xiàn)，GlmU對三種糖-1-磷酸有不同的催化活性，以UTP為核苷三磷酸供體的反應，使用GlcNAcZ-1-P和Glc-1-P的反應得率分別是以GlcNAc-1-P為底物時反應得率的86％和30％。以前的相關研究表明，GlcNAc-1-P的乙酰氨基與酶分子Thr82和Glu154殘基以氫鍵相互作用。Glc-1-P反應轉化率的降低進一步證明了Thr82和Glu154殘基在糖-1-磷酸識別中的重要

9、作用。相反，GlcNAcZ-1-P反應轉化率沒有顯著變化的結果表明GlmU能夠耐受乙酰氨基上的修飾。
　　 第三章結合E.coli來源的GlmU已有晶體結構，克隆并構建了來自E.coli K12的GlmU的N-端結構域(GlGNAc-1-P尿苷轉移酶結構域，GlmU-Tr229)，蛋白表達水平為55 mg/L。為系統(tǒng)研究GlmU-Tr229對不同核苷三磷酸的底物耐受性，研究中使用了GlcNAc-1-P做催化反應底物，使用了12種

10、不同的核苷三磷酸(NTP)，利用毛細管電泳檢測NDP-GlcNAc的合成情況。NDP-GlcNAc產(chǎn)率結果顯示，GlmU-Tr229對不同核苷三磷酸具有一個底物耐受順序:UTP＞dUTP＞dTTP＞＞CTP＞dATP/dm6ATP，這結果表明GlmU對嘧啶核苷酸的利用程度要優(yōu)于對嘌呤核苷酸的利用。
　　 GlmU蛋白晶體研究結果已經(jīng)闡明GlmU N-端催化結構域被兩個突出結構包圍:第一個突出結構(Asn3-Val111及His2

11、16-227)，主要參與識別和結合UDP-GlcNAc的核苷部分;第二個突出結構(Glul12-Val215)則主要是與糖核苷酸中的糖結構相互作用有關。尿嘧啶通過尿嘧啶環(huán)N3與Gln76之間及4位羰基氧與Gln76、Gly81之間形成的氫鍵被識別和結合。核苷中的核糖結構，主要是通過核糖2位的OH基團與Gly14之間的氫鍵作用。我們對GlmU-Tr229的研究結果表明，GlmU N-端催化結構域有非常顯著的底物耐受性，對核糖2位的修飾(d

12、UTP)或者是對尿嘧啶環(huán)C5修飾(dTTP)都不會顯著影響N-端催化結構域的活性。這些結果表明，核糖2位OH與Gly14之間的氫鍵在底物識別過程中不是必需的。
　　 為驗證利用重組GlmU-Tr229合成UDP-GlcNAc衍生物的應用前景，我們在毫克水平上合成了UDP-GlcNAc的兩種衍生物:dUDP-GlcNAc和UDP-GlcNAcZ。并使用mono Q離子交換層析和P2分子篩凝膠對糖核苷酸產(chǎn)物進行分離純化，最終使用ES

13、I-MS和NMR對得到的dUDP-GlcNAc(5.1 mg，57.6％)和UDP-G1cNAcZ(4.3 mg，44.4％)進行了定性分析。
　　 本論文對GlmU-Tr229生化性質(zhì)進行了細致的研究，闡述了GlmU-Tr229催化反應需要依賴金屬離子做輔助因子，GlmU-Tr229對金屬離子的依賴性為:Co2+＞Mn2+＞Mg2+＞＞Zn2+/Cu2+/Ni2+＞EDTA;在以Mg2+為輔助因子的催化反應體系中，5 mM M

14、g2+是最適的金屬離子濃度，研究了pH對GlmU-Tr229催化活性的影響，GlmU-Tr229最適pH是7.5，pH6.5-8.5范圍內(nèi)都能夠催化反應的進行。
　　 我們還對催化反應中副產(chǎn)物焦磷酸的反饋抑制作用進行了研究，通過在反應體系中加入焦磷酸水解酶，將反應體系中累積的焦磷酸水解為無機磷酸根，以UTP和GlcNAc-1-P為底物的催化反應，轉化率由原來的65％提高到95％。
　　 第四章中，我們利用一種六碳糖激酶(

15、NahK)，以ATP和GlcNAc為底物，體外酶促反應合成并分離純化獲得GlcNAc-1-P。探索了一條體外利用NahK合成GlmU反應前體物質(zhì)GlcNAc-1-P的新途徑，解決了GlmU酶學研究底物供給不足的瓶頸。同時，為深入研究GlmU-Tr229底物特異性，我們對GlmU-Tr229的Gln76和Gly81氨基酸位點進行了定點突變研究，并對其中一個突變體Q76E進行了酶學性質(zhì)的研究。通過毛細管電泳檢測發(fā)現(xiàn)Q76E的突變引起了Glm