甲基轉移酶抑制劑AdOx對細胞多能性相關基因調控的研究.pdf

1、胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESC)具有發(fā)育為三個胚層并進一步分化為各種不同類型細胞的潛能被稱為多能性。自我更新和多能性維持是胚胎干細胞的兩個基本特征。ESC的染色質處于一種高度開放的狀態(tài),組蛋白的甲基化修飾在早期胚胎的發(fā)生過程中起著重要的作用。
　　 腺苷二醛(Adenosine dialdehyde,AdOx),抑制了甲基轉移反應中副產物水解酶的活性,從而導致副產物在細胞中的累積而間接抑制了甲基轉移

2、過程,是一種常用的甲基轉移酶的抑制劑。
　　 小鼠P19胚胎瘤細胞(P19 embryonal carcinoma cells)具有胚胎干細胞的許多特征,具有分化成多種細胞類型的潛能和較強的自我更新能力。P19細胞在全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,atRA,簡稱RA)誘導下,可向神經細胞方向分化。是研究胚胎干細胞多能性維持及神經分化機制的很好模型。
　　 本論文利用AdOx處理P19細胞,初

3、步探討了蛋白質甲基化在P19細胞多能性維持中的作用以及在染色質水平的調控機制。
　　 1.AdOx抑制P19細胞的神經分化潛能
　　 P19細胞在RA誘導4天時,細胞聚集成團,在撤除RA4天后,出現神經元樣的細胞。但是用20μM AdOx預處理1天的P19細胞,不能聚集成團,幾乎沒有神經元樣的細胞出現。通過免疫熒光染色計數法發(fā)現,未經AdOx處理的P19細胞中有75％的細胞表達TuJ1蛋白,但經AdOx預處理過的P19細

4、胞中,僅有8％的細胞表達。Western Blot技術檢測發(fā)現,在RA誘導神經分化的第8天,AdOx處理過的P19細胞中TuJ1蛋白的表達量也明顯低于未經AdOx處理的P19細胞,并且,隨著AdOx濃度的增加,AdOx對TuJ1蛋白表達的抑制越強。
　　 Ngn1,Mash1和NeuroD是神經分化過程中關鍵的轉錄因子,利用Real timeRT-PCR檢測發(fā)現,AdOx明顯抑制了RA誘導神經分化過程中ngn1,mash1和ne

5、urodmRNA的表達水平。Id1是一種與神經分化過程相拮抗的轉錄因子,AdOx在一定程度上促進了id1 mRNA的表達。
　　 2.AdOx影響了P19細胞自我更新和多能性的維持
　　 P19細胞具有較強的自我更新和多能性維持能力。我們利用流式細胞術檢測了AdOx對P19細胞周期的影響。結果發(fā)現,AdOx嚴重引起了P19細胞周期阻滯,即使在1μM AdOx處理時就能引起明顯的細胞周期阻滯,1μM,5μM和10μM Ad

6、Ox主要引起S期阻滯,20μM AdOx主要引起G2/M期阻滯。AdOx引起的P19細胞周期的阻滯,嚴重影響了P19細胞的自我更新能力。另外,較高濃度的AdOx也能引起HEK-293A和Hela細胞的細胞周期阻滯。
　　 Real time RT-PCR結果顯示,AdOx促進了P19細胞中多能性相關基因nanog,sox2和fgf4 mRNA的表達,但抑制了多能性關鍵轉錄因子oct3/4的mRNA表達。在撤除AdOx恢復培養(yǎng)的P

7、19細胞中,表達增加的多能性相關基因的mRNA水平逐漸下降,說明AdOx促進多能性相關基因表達的增加是一過性的。Western Blot結果顯示,20μM AdOx增加了P19細胞中Nanog蛋白的表達量,但降低了Oct3/4蛋白的表達量。在恢復培養(yǎng)的P19細胞中,Nanog蛋白的表達量并未持續(xù)升高。AdOx對P19細胞中多能性基因表達產生了不同影響。
　　 經20μM AdOx預處理過的P19細胞在加RA誘導中,干性基因的mR

8、NA表達水平仍能夠迅速下降。但是,在RA誘導的第1天,經20μM AdOx預處理過的P19細胞中l(wèi)in28和fgf4的mRNA表達水平高于未處理細胞中的水平,可能會對RA誘導P19細胞的神經分化有一定干擾。
　　 3.AdOx引起了P19細胞分化潛能的改變
　　 我們發(fā)現AdOx嚴重影響了P19細胞多能性的維持,但卻限制了向神經方向分化的潛能,為了研究AdOx是否引起了P19細胞向其他胚層的分化,我們采用Realtime

9、 RT-PCR技術檢測了AdOx處理后的P19細胞中多胚層轉錄因子的mRNA表達水平。結果顯示,AdOx活化了P19細胞中多胚層標志基因的表達,包括內胚層的Gam6和Sox17,中胚層的Hand1和Brachyury,外胚層的Pax6以及滋養(yǎng)層的Bmp4和Cdx2。說明AdOx引起了P19細胞分化潛能的改變,并且與多能性基因一過性增加相類似,在撤除AdOx后恢復培養(yǎng)1天和2天的細胞中,mRNA表達增加的多胚層標志基因并沒有繼續(xù)增加,而是

10、逐漸下降。提示AdOx處理的P19細胞可能最終也并未分化為某一特定胚層的細胞。
　　 我們在20μMAdOx預處理過的P19細胞中,加入RA誘導2天,利用Real timeRT-PCR技術檢測多胚層標志基因的mRNA表達水平,結果發(fā)現內胚層的Gata6和Sox17,中胚層的Braehyury,外胚層的Nestin以及滋養(yǎng)層的Bmp4和Cdx2的mRNA水平均高于未經AdOx處理過的P19細胞。提示這些轉錄因子可能干擾了P19細胞

11、向神經方向的特異分化。
　　 4.AdOx在P19細胞多能性維持中染色質水平的調控作用
　　 組蛋白甲基化修飾在染色質結構維持和基因表達調控中起著重要的作用。AdOx作為一種甲基轉移酶抑制劑廣泛抑制了多種蛋白質的甲基化過程。我們采用Western Blot方法檢測了AdOx對P19中多種組蛋白甲基化修飾的影響,結果顯示,在總染色質水平上,多種組蛋白的甲基化修飾明顯下降,包括H3K27me3,H3K9me3,H3K4me2

12、,H4K20mel,H4K20me3,H3R17me2,H3R2me2,H4R3me2,提示AdOx改變了P19細胞中的組蛋白修飾模式。
　　 基因表達的活化必然伴隨著其調控區(qū)上抑制性修飾的下降。染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗結果表明,AdOx處理的P19細胞中,抑制性的甲基化修飾包括H3K27me3,H3K9me3和H3K9me2在被AdOx活化的多能性相關基因和發(fā)育基因上均有不同程度的下降,在被AdOx抑制的oct3/4基

13、因上下降不明顯。提示AdOx可能是通過介導了抑制性甲基化修飾的降低引起了多能性相關基因和多胚層標志基因的活化。同時,H4K20mel,H4K20me2和H4K20me3在這些基因上的募集水平均高于IgG,提示H4K20的甲基化修飾也可能參與了這些基因的表達調控。
　　 啟動子活性實驗結果表明,AdOx促進了nanog的啟動子活性,抑制了oct3/4的啟動子活性,與AdOx對nanog和oct3/4 mRNA的影響一致。提示AdO

14、x是在轉錄水平上影響了這兩個基因的差異表達。染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗結果進一步顯示,抑制性的甲基化修飾H3K27me3,H3K9me3和H3K9me2在nanog基因多位點上均下降,而在oct3/4基因多位點上并無明顯下降,提示AdOx可能是通過介導抑制性的甲基化修飾差異調控了P19細胞中nanog和oct3/4基因的表達。
　　 5.AdOx對P19細胞粘附分子的影響
　　 E-Cadherin和N-Cadhe

15、rin是細胞中最常見的兩種粘附分子。Real time RT-PCR結果表明,AdOx促進了e-cadherin粘附分子的表達,而對神經分化特異的n-cadherin粘附分子幾乎沒有顯著影響。
　　 6.AdOx對P19細胞神經分化潛能為不可逆抑制
　　 將用較低濃度AdOx(5μM)處理P19細胞1天,撤除AdOx繼續(xù)恢復培養(yǎng)2天后,再加RA誘導神經分化。Real time RT-PCR結果表明,神經分化過程中關鍵的轉

16、錄因子Ngn1,Mash1和NeuroD的mRNA水平仍被明顯抑制。提示AdOx對P19細胞神經分化潛能的抑制不可逆。并且,在用20μM AdOx處理1天后恢復培養(yǎng)10天的P19細胞巾,內胚層的Gata6,中胚層的Brachyury,外胚層的Pax6和Nestin以及滋養(yǎng)層的Cdx2的mRNA水平均明顯低于正常培養(yǎng)的P19細胞中的mRNA水平。提示,AdOx處理過的P19細胞可能已不再是正常的具有分化潛能的P19細胞。
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17、.蛋白質甲基轉移酶CARM1可能在RA誘導P19細胞神經分化過程中起作用
　　 Western Blot檢測顯示CARM1在RA誘導P19細胞神經分化早期明顯增加,且免疫熒光實驗發(fā)現CARM1入核明顯,提示CARM1可能在RA誘導P19細胞的神經分化過程中起作用。
　　 綜合以上結果,我們發(fā)現AdOx限制了P19細胞的神經分化潛能,引起了P19細胞周期的阻滯,影響了P19細胞的自我更新和多能性維持能力。AdOx可能通過抑