miR-486-5p靶向SIRT1抑制肝癌干細胞功能的相關研究.pdf

1、腫瘤組織中的腫瘤細胞并不是均一的群體，其中存在一小部分細胞，這一小部分的細胞具有自我更新并產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤的能力，表現(xiàn)出干細胞樣特性，被稱為腫瘤干細胞(CSC)。腫瘤干細胞的發(fā)現(xiàn)為闡明腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥提供了理論依據(jù)。許多研究提示腫瘤干細胞可能是腫瘤發(fā)生、復發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的根源，探索腫瘤干細胞的作用和調(diào)控機制，有望為開發(fā)靶向腫瘤干細胞的新的治療手段奠定基礎。
　　微小RNA(miRNA)是一類非編碼的小分子RNA，長度約為19-

2、22個核苷酸的小分子。miRNA由具有發(fā)夾結構的大小約為70-90nt的單鏈前體經(jīng)過Dicer酶進行剪切加工生成，其通過與靶基因的3'非編碼區(qū)(3'UTR)堿性互補配對相結合，可以特異性抑制或降解靶基因的mRNA，進而抑制靶基因的翻譯，調(diào)節(jié)靶基因的表達。越來越多的證據(jù)表明，micoRNA在許多腫瘤中表達異常，能夠參與腫瘤的形成、生長、轉(zhuǎn)移、復發(fā)和耐藥等，其中一些miRNAs與肝癌干細胞特性維持有著密切的聯(lián)系。因此，尋找在肝癌干細胞和肝癌

3、非干細胞中差異表達顯著的miRNA，無疑具有重要意義。
　　本課題研究思路為:首先，篩選肝癌干細胞中表達顯著下調(diào)的miRNA，在此基礎上獲得可能在肝癌干細胞維持中發(fā)揮重要作用的候選miRNA，進一步研究驗證候選miRNA對腫瘤干細胞的生物學作用的影響并明確其發(fā)揮作用的靶基因。
　　第一部分通過The Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫，比較肝癌組織與癌旁組織中miRNAs的表達情況，篩選在肝癌組織中表達

4、下調(diào)的miRNAs。結果顯示，59個miRNAs在肝癌組織中表達下調(diào)顯著。進一步，我們通過成球?qū)嶒?tumor sphere)體外富集肝癌干細胞，并利用熒光定量PCR技術進行篩選驗證候選miRNAs在貼壁細胞和成球干細胞(Huh7和PLC)中的表達情況，意圖尋找在肝癌干細胞中顯著下調(diào)的miRNA。結果顯示miR-99a、miR-10a、miR-486、miR-195、miR-154和miR-138表達下調(diào)明顯。利用流式細胞術分選CD13

5、陽性和陰性細胞、EpCAM陽性和陰性細胞，進一步篩選在CD13和EpCAM雙陽性細胞中均表達下調(diào)顯著的miRNA，結果顯示miR-486-5p在CD13+EpCAM+細胞中下調(diào)顯著。該部分研究結果表明:miR-486-5p在肝癌組織和肝癌干細胞中下調(diào)顯著。有研究表明miR-486-5p作為抑癌基因，在某些腫瘤中發(fā)揮作用，例如肺癌、胃癌等[7,8]。但是miR-486-5p在肝癌發(fā)生發(fā)展中的生物學作用，尤其是其對肝癌干細胞的作用未見報道，

6、因此，在第二部分工作中，開展miR-486-5p對肝癌細胞以及肝癌干細胞生物學作用的研究。
　　第二部分利用慢病毒包裝系統(tǒng)，獲得miR-486-5p過表達的毒液上清，攻擊肝癌細胞，建立穩(wěn)定過表達miR-486-5p的肝癌細胞系;利用成球?qū)嶒?tumor sphere)、侵襲實驗、劃痕實驗、CCK8細胞耐藥實驗及裸鼠皮下成瘤實驗，探究miR-486-5p對肝癌干細胞的成球、侵襲、遷移、耐藥和成瘤能力的影響;利用熒光定量PCR技術和流

7、式細胞術，探究miR-486-5p對肝癌干細胞干性基因及干性表面標志物的影響。結果顯示，miR-486-5p可以體外抑制肝癌干細胞的增殖、侵襲遷移、耐藥、干性基因和標志物的表達，體內(nèi)抑制肝癌細胞的成瘤能力。
　　第三部分為了進一步探討miR-486-5p對肝癌干細胞的作用機制，利用生物信息學在線網(wǎng)站TargetScan、Pictar和microRNA.org預測miR-486-5p的靶基因，從腫瘤、增殖、轉(zhuǎn)移和干性四方面篩選miR

8、-486-5p的候選靶基因;熒光定量PCR技術驗證在miR-486-5p過表達或干涉的肝癌細胞和成球干細胞中其候選靶基因的表達情況;利用免疫組化和qRT-PCR技術，進一步驗證在肝癌組織中miR-486-5p與靶基因的關系;最后利用雙熒光素酶報告實驗，明確miR-486-5p的靶基因。結果顯示，在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平，SIRT1與miR-486-5p的表達呈負相關關系;根據(jù)miR-486-5p與SIRT13'UTR的結合情況，證明SIRT

9、1是miR-486-5p的靶基因之一。
　　第四部分利用RNA干擾技術(RNAi)，構建SIRT1的慢病毒干涉載體;利用慢病毒包裝系統(tǒng)，構建穩(wěn)定低表達SIRT1的肝癌細胞系;通過成球?qū)嶒?、平板克隆實驗、CCK8細胞增殖實驗、耐藥實驗及裸鼠皮下成瘤實驗，探究SIRT1對肝癌干細胞的增殖和耐藥的影響。結果顯示，成功構建SIRT1慢病毒干涉載體，獲得穩(wěn)定低表達SIRT1的肝癌細胞系，并證明SIRT1促進肝癌細胞和肝癌干細胞的增殖、耐藥和

10、成瘤能力。
　　綜上，我們的工作首先證實了miR-486-5p可抑制肝癌干細胞的增殖、干性特征、侵襲、遷移、耐藥和體內(nèi)成瘤能力。其次，揭示了miR-486-5p對肝癌干細胞的作用是通過調(diào)控SIRT1的表達來實現(xiàn)的。
　　該研究的意義在于:人工合成的miRNA與小分子化合物的功能相似，可以用于疾病的治療。同時miRNA可以被作為診斷腫瘤的生物標志物或治療靶點。miR-486-5p有望作為一個新的靶向肝癌干細胞的miRNA，為肝