SLC38A3通過激活Akt信號通路誘導EMT促進非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移.pdf

1、肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其死亡率是惡性腫瘤總死亡率的1/4，高居于首位。隨著全球環(huán)境日益惡化，許多城市出現(xiàn)霧霾殺手，肺癌的發(fā)病率更是持續(xù)增長，且有明顯的年輕化趨勢，而且肺癌極容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。肺癌按照臨床特征分為小細胞肺癌(Small cell carcinoma, SCLC)和非小細胞肺癌(Non-small-cell carcinoma，NSCLC)，前者僅占15％，而5年生存率極低的非小細胞肺癌占了總肺癌的85％。非小細胞型肺癌

2、極易轉(zhuǎn)移到一些血供豐富的重要組織器官，如腦、肝、脊柱等。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個極為復雜的過程，目前有研究認為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。EMT是一個多轉(zhuǎn)錄因子參與的復雜過程，參與其中的信號通路主要有依賴Smad和非依賴Smad的TGF-β通路、AKT信號通路、STAT3信號通路等等。將EMT的機制研究清楚，可以通過這些信號通路阻斷EMT進程，從而防止

3、腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　SLC38家族是人溶質(zhì)載體家族(Solute Carrier Family)中第38號家族，是一類Na耦聯(lián)中性氨基酸轉(zhuǎn)運的蛋白家族，共有11個成員，其中SLC38A3主要位于細胞膜上，可依賴Na+和H+進行雙向跨膜運輸，主要轉(zhuǎn)運谷氨酰胺、組氨酸、丙氨酸、天冬酰胺等。由于腫瘤細胞具有快速、無限增長的特性，其對營養(yǎng)物質(zhì)的需求也不同于正常細胞。目前研究認為，許多腫瘤細胞可以通過改變代謝方式和/或增加對谷氨酰胺的依賴性從而

4、為自身的生長提供原料。SLC38A3是一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白，其特殊的氨基酸轉(zhuǎn)運方式提示它在氮代謝和傳遞過程中具有重要作用。了解SLC38A3在非小細胞肺癌中的表達情況及其與肺癌的相關(guān)性具有重要的臨床臨床意義，明確其在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機理可為進一步尋找非小細胞肺癌治療的靶點提供依據(jù)。
　　目的:
　　1.了解溶質(zhì)載體轉(zhuǎn)運蛋白SLC38A3在非小細胞肺腺癌腫瘤組織和非小細胞肺癌細胞株中的表達情況。
　　2.研究

5、溶質(zhì)載體轉(zhuǎn)運蛋白SLC38A3促進非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的機制。
　　方法:
　　組織芯片免疫組化檢測臨床非小細胞肺癌組織中SLC38A3的表達;WesternBlot檢測非小細胞肺癌細胞株中SLC38A3的表達;網(wǎng)站分析SLC38A3表達與肺癌病人生存期的關(guān)系;構(gòu)建肺癌細胞Hcc827的SLC38A3過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系;質(zhì)譜分析技術(shù)分析SLC38A3過表達后細胞內(nèi)其轉(zhuǎn)運氨基酸的變化;Western Blot檢測SLC38A3過表達

6、對EMT標志蛋白的變化;對細胞形態(tài)觀察、劃痕實驗和transwell實驗等研究過表達SLC38A3對非小細胞肺癌生物學行為的影響;進一步通過Western Blot檢測過表達SLC38A3對腫瘤細胞EMT信號通路的影響。
　　結(jié)果:
　　我們用組織芯片檢測了75例臨床肺腺癌病人腫瘤組織中SLC38A3的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁對照組織相比，所有腫瘤組織中SLC38A3的表達均明顯上調(diào)，差別有顯著的統(tǒng)計學意義(p=0.0088

7、)，并且SLC38A3在原位肺癌病人癌組織中的表達量灰度值125.226±20.3725，而在Ⅲ級肺癌病人體內(nèi)表達量灰度值為184.7093±17.6235，差別有統(tǒng)計學意義(p=0.0097)。通過Kaplan Meier plotter網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn):SLC38A3低表達組肺癌病人100個月生存概率為0.553，200個月生存概率為0.357，而高表達組100個月生存率不到0.4，到200個月生存概率已趨近于0。成功構(gòu)建過表達SLC3

8、8A3穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系后，Western Blot、細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)SLC38A3過表達的非小細胞肺癌Hcc827細胞株EMT上皮表型標志蛋白E-Cadherin的表達明顯下降，而EMT間質(zhì)表型標志物N-Cadherin的表達卻明顯升高。劃痕實驗發(fā)現(xiàn)SLC38A3過表達后經(jīng)48h，劃痕閉合為原來的58.4％，而對照組僅閉合了40％，差異有顯著意義。Transwell實驗證明了SLC38A3過表達組細胞透過生物膜的細胞數(shù)為對照組的三倍。質(zhì)譜

9、分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)SLC38A3過表達后由其轉(zhuǎn)運谷氨酰胺和組氨酸在細胞內(nèi)含量分別降低了71.8％、80.8％。實驗室前期檢測發(fā)現(xiàn)SLC38A3過表達后，p-AKT(Thr308)表達上調(diào)，下游的p-GSK3β、β-catenin、snail也上調(diào)。Snail是EMT一個非常重要的效應分子。在此之后，我們加入AKT抑制劑MK22065um/L處理5小時阻斷這一信號通路后，效應分子snail下調(diào);同樣濃度處理96h后，SLC38A3過表達組細胞形

10、態(tài)變得規(guī)則致密，而未經(jīng)抑制劑處理的過表達組依然保持松散梭形形態(tài)。此外，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)SLC38A3過表達后p-mTORC1及其下游的p-S6K1表達均升高，而抑制mRNA翻譯的4EBP-1下調(diào)。綜上所述，外源性高表達SLC38A3可激活AKT信號通路誘導非小細胞肺癌發(fā)生EMT。
　　結(jié)論:
　　1.SLC38A3在臨床非小細胞型肺癌病人癌組織中的表達明顯高于在癌旁組織的表達，且與肺癌病人生存期負相關(guān)。