犬冠狀病毒的分離鑒定及其S基因的克隆.pdf

1、2006年3月，公安部警犬技術學校2只警犬發(fā)病，經(jīng)初步診斷后，疑似犬冠狀病毒(CCV)病。我們對提供的犬冠狀病毒(CCV)癥狀病犬的糞便，以犬腎傳代細胞(MDCK)等多種細胞進行了病毒分離，結果分離到1株病毒，在熒光顯微鏡下觀察到犬冠狀病毒的特征，進而對該病毒進行了形態(tài)學、理化學、生物學鑒定以及RT-PCR鑒定等方面研究。最后將分離得到的CCV病毒S基因克隆到相應載體中構建重組質粒，這對進一步研究CCv病毒的原核表達工作以及基因疫苗的研

2、制工作提供了必要的信息和資料，實驗設計及結果為： 1．從犬冠狀病毒(CCV)癥狀病犬糞便中分離出一株病毒，采用物理化學實驗、動物回歸實驗等方法進行鑒定。實驗結果為：細胞培養(yǎng)證實該病毒有致細胞病變效應；物理化學鑒定結果表明，分離病毒核酸類型為RNA，對氯仿、乙醚敏感，對1％胰蛋白酶不敏感，耐酸性較強，具有一定的耐熱性，無血凝性和紅細胞吸附特性；中和試驗證明該分離病毒是一種犬冠狀病毒；動物回歸實驗表明，本次分離病毒株可以引起試驗犬

3、出現(xiàn)典型犬冠狀病毒病癥狀。 2．合成通用引物(2Bp，4Bm)和Matthew等設計的CCV S基因區(qū)特異性引物(CCVF2，CCVR2)對分離病毒進行RT-PCR反應及限制性內切酶BastX Ⅰ酶切鑒定，并將純化的PCR產(chǎn)物成功地克隆到pGEM-T-easy載體中。結果為：通用引物(2Bp，4Bm)和特異性引物(CCVF2，CCVR2)擴增均得到預期片段250bp,以及514bp，并且BstX Ⅰ酶切CCVF2、CCVR2的

4、PCR產(chǎn)物，于瓊脂糖凝膠上可見到大小為187 bp和327 bp兩個核苷酸片段?；厥找顲CVF2，CCVR2擴增得到長度約為514 bp較亮的DNA片段，并將其直接克隆到pGEM-T-easy載體中，轉化E.coli JM109，并擴增培養(yǎng)，對重組質粒采用CCV特異性引物(CCVF2，CCVR2)進行PCR，得到預期擴增片段514bp,測序結果與GenBank的CCV序列進行比對，與之相符。 結論： 1．形態(tài)學、理

5、化學、生物學及動物回歸實驗等多方面鑒定，證明所分離病毒為犬冠狀病毒．RT-PCR反應結果,BstX Ⅰ酶切鑒定均得到預計擴增片段，證明所分離病毒為犬冠狀病毒． 2．回收犬冠狀病毒特異性引物CCVF2，CCVR2擴增的S蛋白特異性基因片斷并將其克隆入pGEM-T-easy載體中，進行PCR鑒定及測序，結果表明成功構建了pGEM-T-easy/CCV 重組質粒． 3. S基因序列分析比較發(fā)現(xiàn)，分離培養(yǎng)出的CCV病毒和CC