赤魟（Dasyatis akajei）白細胞介素8（Interleukin-8）的功能研究與進化分析.pdf

1、以我國南海海洋生物軟骨魚赤魟作為研究對象，綜合應用基因工程、蛋白純化等分子生物學、細胞生物學和生物信息等功能基因組研究方法和技術手段進行研究。在實驗室已克隆的赤魟白細胞介素8(IL-8)基因序列的基礎上，對趨化因子家族重要成員的IL-8進行進化與功能的分析和研究，并且制備了多克隆抗體，為利用免疫學方法進一步研究提供了必需的輔助材料。以期開發(fā)軟骨魚赤魟的分子生物學資源，并在闡明IL-8基因在魚類中的生理活性機制基礎上，為其潛在應用價值提供

2、直接的實驗證據支持。 氨基酸序列分析表明，赤魟IL-8具有保守的四個半胱氨酸(Cys)，且N端為CXC，屬于CXC型趨化因子。和其它已報導的魚類IL-8一樣，赤缸IL-8缺乏經典的ELR motif，并且與人、鼠等哺乳類的IL-8氨基酸序列同源性較低。不同于哺乳動物中IL-8序列的高度保守，已報道的魚類中的IL-8序列相似性也較低，這可能跟魚類中IL-8 正在高速進化有關。 選取赤魟IL-8的成熟肽構建了硫氧還蛋白(TR

3、X)融合表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中進行了原核表達。以0.2mM IPTG做誘導劑25℃過夜誘導表達12小時，成功獲得了可溶的重組融合蛋白rTRX-IL8。采用Ni<'2+>螯和親和層析和G25分子篩等純化步驟獲得到了較高純度的重組IL-8成熟蛋白。HPLC分析純化后的重組IL-8蛋白純度在80～90﹪之間。 制備了多克隆抗體，Western blotting結果顯示純化后的抗體特異性良好，Dotblotting檢測

4、抗體效價達到了1:50，000。為利用免疫學方法進一步研究IL-8基因，及其表達產物的性質、功能以及調節(jié)炎癥反應及抑制腫瘤遷移的可能作用機制等提供了必需的輔助材料。對赤魟重組IL-8的生物學活性進行了研究。赤魟重組IL-8對豚鼠中性粒細胞的體外趨化實驗結果顯示其確實具有中性粒細胞趨化功能，并且這種趨化作用呈濃度依賴性。赤魟的IL-8雖然缺乏ELR motif，依然具有趨化中性粒細胞的功能，讓我們聯想到魚類中IL-8趨化功能的行使可能與E