磷霉素對鮑曼不動桿菌生物被膜干預(yù)作用的體外研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行闡述：
　　第一部分 鮑曼不動桿菌生物被膜體外模型的建立和分析
　　目的：建立鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii，Ab)的體外生物膜(biofilm，BF)模型，觀察和定量分析鮑曼不動桿菌BF形成的動態(tài)過程。
　　方法：采用生物膜定性陽性的臨床分離的Ab菌株（編號2814）為實驗菌株，以載玻片為載體，建立Ab體外靜止生物膜模型，分別于建模第4、12、24、48、72、9

2、6h，以結(jié)晶紫染色法定量載體表面BF的量，電子掃描顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察載體表面BF的形態(tài)及結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：Ab臨床菌株能夠在玻片載體上形成BF，建模12h、24h、48h、72h、96h時，載體表面BF結(jié)晶紫定量結(jié)果分別是0.16±0.04、0.61±0.09、1.58±0.92、2.09±0.17和1.46±0.49;而SEM可見24h時載體表面Ab成團聚集，菌體外可見

3、少量黏液樣物質(zhì)包裹，細(xì)菌輪廓依稀可見。72h時載體表面黏液樣物質(zhì)稠密，呈立體樣結(jié)構(gòu)，不見細(xì)菌輪廓。
　　結(jié)論：鮑曼不動桿菌可在無生命的玻片載體上形成BF，BF的形成是一個動態(tài)的過程。24h形成早期BF，72h形成成熟BF。
　　第二部分 磷霉素對鮑曼不動桿菌生物被膜形成的抑制作用
　　目的：觀察磷霉素抑制鮑曼不動桿菌對載體表面黏附作用及其對鮑曼不動桿菌生物被膜形成的抑制作用。
　　方法：采用微量肉湯稀釋法分別測定

4、磷霉素(FOS)和紅霉素(EM)對Ab的最低抑菌濃度(MIC)。建立Ab生物被膜體外模型，分為空白對照組、FOS組、EM組，于開始建模時就加入FOS(1/2MIC)和EM(1/4MIC)。第一組于建模24小時后，SEM聯(lián)合連續(xù)稀釋法活菌計數(shù)來檢測載體表面Ab黏附量;另一組于建模第三天，采用結(jié)晶紫染色法定量載體表面BF的量、SEM觀察載體表面BF的形態(tài)、連續(xù)稀釋法檢測載體表面BF內(nèi)活菌數(shù)。
　　結(jié)果：FOS、EM對Ab的MIC分別是

5、128μ g/ml、256μ g/ml。各組載體表面Ab的黏附量:電鏡下觀察:空白對照組可見Ab相互聚集，并被薄層黏液樣物質(zhì)包裹，而FOS組及EM組僅見少量散在游離的Ab;載體表面的活菌計數(shù)結(jié)果顯示:FOS組與EM組均少于空白對照組(P＜0.01)，且FOS組少于EM組(P＜0.05)。建模3天后，SEM觀察:空白對照組可見濃厚的黏液樣物質(zhì)，而FOS組及EM組僅見稀薄的黏液樣物質(zhì);結(jié)晶紫染色法半定量BF: FOS組及EM組均少于空白對照

6、組(P＜0.01)，且FOS組少于EM組(P＜0.01);BF內(nèi)活菌計數(shù):FOS組與EM組均少于空白對照組（P＜0.01），且FOS組少于EM組(P＜0.01)。
　　結(jié)論：FOS可以抑制Ab對載體的黏附，進而抑制其BF的形成及成熟，且其抑制作用強于EM。
　　第三部分 磷霉素對鮑曼不動桿菌生物被膜的破壞作用及其與左氧氟沙星的協(xié)同殺菌作用
　　目的：觀察磷霉素與左氧氟沙星聯(lián)合應(yīng)用對30株多重耐藥鮑曼不動桿菌（MD R-

7、Ab）的體外抗菌活性，同時探討磷霉素對Ab生物被膜的破壞作用及其與左氧氟沙星聯(lián)合對BF內(nèi)Ab的殺菌作用。
　　方法：(1)采用棋盤法分別測定不同濃度組合的抗菌藥物對30株MDR-Ab的最低抑菌濃度，并計算出部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)，判定聯(lián)合效應(yīng)。(2)測定左氧氟沙星(LFX)對Ab（編號2814）的MIC。(3)建立Ab體外生物被膜模型，分為空白對照組、磷霉素組、紅霉素組、左氧氟沙星組、磷霉素+左氧氟沙星組、紅霉素+左氧氟沙星

8、組。于建模第三天分別加入上述對應(yīng)的抗生素及組合，各組分別于抗生素作用0小時、4小時、8小時、24小時后，采用結(jié)晶紫染色法定量載體表面BF的量、連續(xù)稀釋法進行載體表面BF內(nèi)活菌計數(shù)，另外，各組載體均于24小時后于SEM下觀察載體表面BF的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：(1) FICI≤0.5占57.5％;0.5＜FICI≤1占40.6％;1＜FICI≤2占1.9％; FICI＞2占O％。(2)左氧氟沙星對Ab的MIC是16μ g/ml。(3

9、) Ab成熟BF經(jīng)抗生素及其組合作用24小時后，SEM觀察發(fā)現(xiàn)，磷霉素組與紅霉素組載體表面黏液樣物質(zhì)與空白對照組比較，BF結(jié)構(gòu)破壞明顯，且磷霉素組明顯于紅霉素組。左氧氟沙星組載體表面BF結(jié)構(gòu)與空白對照組比較，變化不大。磷霉素+左氧氟沙星組與紅霉素+左氧氟沙星組載體表面粘液樣物質(zhì)較空白對照組明顯減少。各組間載體表面BF的量的變化:左氧氟沙星組與空白對照組各個時間點的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);磷霉素組和紅霉素組與空白對照組比較

10、，第24小時總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），吸光度值:磷霉素組＜紅霉素組＜空白對照組;磷霉素+左氧氟沙星組和紅霉素+左氧氟沙星組與空白對照組比較，從第8小時開始，總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，吸光度值:磷霉素+左氧氟沙星組＜紅霉素+左氧氟沙星組＜空白對照組。載體表面BF內(nèi)活菌計數(shù):磷霉素組、紅霉素組與空白對照組各個時間點的比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;左氧氟沙星組與空白對照組比較，第24小時有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）