白藜蘆醇對(duì)高糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病是一種代謝紊亂疾病，可以導(dǎo)致糖尿病特有的微血管并發(fā)癥（視網(wǎng)膜病變、腎病、神經(jīng)病變）和大血管并發(fā)癥（心血管疾病和中風(fēng)），最終導(dǎo)致壽命縮短。糖尿病視網(wǎng)膜病(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病常見(jiàn)和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是成人后天性致盲的主要原因，在失明的患者中85％是由DR引起。DR的特點(diǎn)是新生血管形成，發(fā)病機(jī)制一般認(rèn)為是由于視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)受損所致，是多種因素相互作用導(dǎo)致，主要包括周細(xì)胞丟

2、失、視神經(jīng)網(wǎng)膜異常和新生血管形成。而視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生是新生血管形成的前提。
　　白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是從紅酒內(nèi)提取的多酚類物質(zhì)，它對(duì)眼部的主要作用包括:抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡、抗腫瘤基因、抗炎、抗血管生成以及血管舒張。基于新血管生成是糖尿病眼病發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制之一，本研究觀察了Res對(duì)高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRCECs）增殖和細(xì)胞周期的干預(yù)作用，并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行了探討，為Res在糖尿病

3、眼病治療方面提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)
　　將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRCECs）接種于96孔板中，分為:高滲組(M)（25 mmol/L甘露醇），正常糖濃度組(N)（5.5 mmol/L葡萄糖），高糖組(H)（25 mmol/L葡萄糖），高糖+白藜蘆醇組(R)（R1、R2、R3、R4組分別為25mmol/L葡萄糖加入25、50、100、200μmol/L Res），作

4、用24 h后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。
　　細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)藥物作用24h后的HRCECs細(xì)胞增殖活性，處理?xiàng)l件同上。
　　2、細(xì)胞周期的檢測(cè)
　　分為高滲組(M)（加入25 mmol/L甘露醇），正常糖濃度組(N)（5.5 mmol/L葡萄糖），高糖組(H)（25 mmol/L葡萄糖），高糖+白藜蘆醇組(R)（R2、R3組分別為25mmol/L葡萄糖加如50、100μmol/L Res），培養(yǎng)24h后，用流式細(xì)胞儀

5、檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。
　　3、分組情況同方法2，Westem blot及real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及其上游mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞增殖活性的檢測(cè):與正常糖濃度組(N)相比，高滲組(M)細(xì)胞增殖活性無(wú)顯著性差異，而高糖組(H)細(xì)胞增殖活性則明顯增高(P＜0.05);不同濃度的Res處理24h后，R1、R2、R3、R4組細(xì)胞增殖活性較高糖組分別下降了4％、11％、16、47％，

6、其中R2、R3、R4組與高糖組比較有顯著性差異(P＜0.05)（Fig.2A）;
　　細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果顯示，與正常糖濃度組(N)相比，高滲組(M)無(wú)顯著性差異，而高糖組(H)細(xì)胞計(jì)數(shù)則明顯增高(P＜0.05);用不同濃度的Res作用HRCECs細(xì)胞24 h后，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，與H組相比，R1、R2、R3、R4組細(xì)胞數(shù)量分別減少了17％、41％、58％、75％(P均＜0.05)(Fig.2B, Fig.3)。
　　2、流式細(xì)

7、胞學(xué)結(jié)果:高糖組(H)S期的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P＜0.05)。高糖環(huán)境下不同濃度Res（50、100μmol/L）處理24h后，可使處于S期的細(xì)胞數(shù)顯著增加(P＜0.05），抑制高糖環(huán)境下HRCECs細(xì)胞周期進(jìn)程（Fig.4，Table1）。
　　3、Western blot及Real-time PCR結(jié)果示:與正常糖濃度組(N)比較，高滲組(M)細(xì)胞的cyclin A1、CDK2、PCNA mRNA及蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性差異，而高

8、糖組(H) cyclin A1、CDK2、PCNA的表達(dá)增加，P21CIP1表達(dá)下降，P均＜0.05; Res（50、100μmol/L）處理24h可劑量依賴性地抑制高糖下HRCRCs細(xì)胞的cyclin A1、CDK2、PCNA的表達(dá)，增加P21CIP1的表達(dá)量(P均＜0.05)(Fig.5-Fig.8，Table2，Table3)。
　　結(jié)論:
　　1、高糖培養(yǎng)可能通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的影響及上調(diào)cyclin A1、CDK2、P