杜氏鹽藻寡糖基轉移酶亞基STT3a的基因克隆與功能分析.pdf

1、N-連接糖基化是真核生物細胞中最常見的蛋白質修飾，這個過程是由位于糙面內質網膜上的寡糖基轉移酶(OST)催化的。Stt3p為OST的催化亞基，它在已知的OST亞基中是最保守的。研究發(fā)現(xiàn)酵母的Stt3p編碼一個78 kDa的蛋白，并且?guī)缀跛械恼婧松锘蚪M中都存在編碼酵母Stt3p蛋白的同系物。哺乳動物的基因組編碼酵母Stt3p的兩種同系物STT3a和STT3b，它們的表達具有組織特異性差異，并能調節(jié)OST的活性，且含有一個STT3a亞

2、基的OST比含有STT3b亞基的OST對于選擇完全裝配的長鏈寡糖供體(Glac3Man9Glc NAc2-PP-Dol)更具有特異性。最近的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥OST的STT3a亞基作為一種跨膜蛋白在高鹽應激反應中發(fā)揮一定作用。
　　 杜氏鹽藻(Dunaliella salina，D.salina)是一種高度耐鹽的單細胞雙鞭毛真核綠藻，它沒有細胞壁，能夠在0.5～5 mol/L NaCl鹽濃度下生存，具有很強的滲透調節(jié)能力。近年來，雖

3、然人們圍繞鹽藻的耐鹽機制進行了大量的研究，但是目前對其耐鹽機制還不是十分清楚。另外，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)：在高鹽條件下，鹽藻的運動性明顯降低，而作為鹽藻運動器官的鞭毛直接參與了鹽藻的運動。
　　 為了解跨膜蛋白STT3a在鹽誘導反應中的作用及鹽藻的鹽耐受性和鞭毛介導的運動性之間是否有潛在的聯(lián)系，本研究根據衣藻、擬南芥等STT3a蛋白的氨基酸高度保守序列VCVFTA、DVDYVL設計一對簡并引物，采用RT-PCR及RACE的方法擴增

4、獲得杜氏鹽藻STT3a基因全長的cDNA序列。然后將杜氏鹽藻STT3a的cDNA全長序列定向克隆于原核表達載體pET-28a(+)中構建重組質粒，利用SDS-PAGE方法，分析STT3a融合蛋白在大腸桿菌BL21中的表達情況。并通過Primer Premier5.0在STT3a結構域中設計一對特異性引物，分別提取不同鹽濃度培養(yǎng)條件及鞭毛再生狀態(tài)下的杜氏鹽藻cDNA，通過實時熒光定量PCR分析STT3a在杜氏鹽藻鹽誘導及鞭毛再生過程中的作

5、用。另外，運用改進的銀染法對杜氏鹽藻鞭毛及藻體進行銀染，并根據公式V=(S2-S1)/t(其中V為相對生長速率，S2和S1分別為相鄰兩個時間點的鞭毛長度平均值，t代表間隔時間)，最終求出杜氏鹽藻鞭毛再生不同時期的相對生長速率。
　　 序列分析顯示克隆得到的杜氏鹽藻STT3a基因cDNA全長序列為2574 bp，包括114 bp的5'UTR、279 bp的3'UTR以及2181 bp的開放閱讀框(open readingframe

6、，ORF)，編碼727個氨基酸殘基，其蛋白質的理論等電點為9.11，分子量為80.25 kDa。對所得氨基酸序列進行同源性分析，BLAST結果顯示，克隆所得的序列為杜氏鹽藻STT3a蛋白的基因序列。SDS-PAGE結果顯示：在80 kDa左右出現(xiàn)一條特異性條帶，與預測的蛋白分子量大小一致。實時熒光定量PCR結果顯示杜氏鹽藻STT3a mRNA水平隨著鹽濃度的升高而逐漸增加，其水平在3.5mol/L，NaCl濃度時比在1.5 mol/L