利用T-DNA標簽法誘變洋桔梗的研究.pdf

1、洋桔梗(Eustoma grandiflorum)是目前世界上較為流行的切花，是十大切花種類之一。我國大陸地區(qū)對洋桔梗的引種較晚，很多地方還處于試驗種植階段，至今仍未報道有新品種的育成。T-DNA標簽法，其插入的位點可以貫穿整個基因組，甚至達到飽和，幾乎可以標簽到所有的基因。因此使用T-DNA標簽法可誘導洋桔梗進行突變并進行基因功能的研究。 本研究以洋桔梗(Eustoma grandiflorum)“Double Mariach

2、i Pink”品種為試材，對其農桿菌介導的葉盤轉化法進行了優(yōu)化，為利用T-DNA標簽法研究洋桔梗突變建立了高效的轉化體系，通過本研究建立的抗性篩選體系成功構建了突變庫，為有價值的變異株系的獲得或基因功能的研究奠定了基礎。本研究建立了洋桔梗ISSR最佳反應體系，并對不同株系洋桔梗進行了ISSR分子鑒定。 首先，本研究以洋桔梗葉片為外植體，在“三刀切”切割方式的基礎上，對外植體農桿菌侵染的共培養(yǎng)時間進行了優(yōu)化。研究結果表明：共培養(yǎng)5

3、d、6d的葉片在轉化率和獲得抗性苗數(shù)上沒有顯著差異，但明顯高于其他梯度，因此確立共培養(yǎng)天數(shù)為5d，轉化效率可達到57.7％。GUS瞬間表達檢測的結果也支持上述結論：3d預培養(yǎng)時間和5d共培養(yǎng)時間，農桿菌介導的洋桔?！叭~盤法”轉化效率最高。同時，本研究運用了一種新的葉片切割方法——“刺孔法”，與傳統(tǒng)的“三刀切”進行了再生效率和轉化效率的比較，結果顯示：“刺孔法”切割方式處理的葉盤，平均每對葉塊再生芽數(shù)達到了23.36個，明顯高于“三刀切”

4、的19個：“刺孔法”基礎上農桿菌侵染效率和每葉轉化數(shù)分別達到了77.7％和0.64個，明顯高于“三刀切”的57.7％和0.38個。農桿菌介導的洋桔梗“葉盤法”高效轉化體系的建立，為T-DNA標簽法誘變洋桔梗構建了良好的受體系統(tǒng)和技術平臺。 其次，本研究根據(jù)洋桔?！皾撎硬欢ㄑ俊陛^多的情況，建立了適合于篩選洋桔?？剐栽偕康暮Y選體系。通過生根篩選后得到89個生長良好的抗性洋桔梗再生株系，對其中挑選的13個株系進行PCR鑒定和GUS表

5、達檢測，得到8個PCR陽性株系和4個GUS表達陽性株系，PCR陽性株系占隨機選用株系總體的61.5％，初步確定T-DNA已轉入上述株系中，為后期有價值變異株系的獲得和相應基因功能的研究奠定了基礎。 再次，本研究利用正交實驗建立了洋桔梗ISSR最佳反應體系：含10×Buffer(Mg2+free)，Mg2+濃度為1.5mmol/L，dNTPs濃度為0.3mmol/L，引物濃度為0.21μmol/L，模板濃度為30ng，Tag DN