壬基酚與苯并芘對河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）雌激素受體影響的研究.pdf

1、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs)是存在于環(huán)境中的一些人工合成的化學物質(zhì)。通過環(huán)境介質(zhì)和食物鏈進入人體或生物體內(nèi)，干擾其內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖功能，影響后代的生存和繁衍。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物種類繁多，作用機制復雜，如類雌激素和類抗雌激素的拮抗效應(yīng)、類雌激素間的協(xié)同效應(yīng)等。為此，關(guān)于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的作用機理以及對其的檢測和監(jiān)測已成為生態(tài)毒理學研究的熱點。本文以河川沙塘鱧為研究載體，利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)和實時熒光定量PCR(real-tim

2、e PCR)的方法研究環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對魚類雌激素效應(yīng)的作用機制，并使之應(yīng)用于太湖流域水環(huán)境的環(huán)境雌激素的監(jiān)測當中。 本實驗從抽提河川沙塘鱧肝臟mRNA入手，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計合適的擴增引物并優(yōu)化PCR擴增條件，最后得到河川沙塘鱧的卵黃蛋白原(Vtg)、雌激素受體α(ERα)、雌激素受體β(ERβ)基因的cDNA片段。測序并將其上傳至www.ncbi.nlm.nih.gov進行BLAST。結(jié)果顯示經(jīng)本實驗擴增得到的Vtg

3、cDNA序列與矛尾刺鰕虎魚的有70％同源性，ERα cDNA序列與食蚊魚的有100％同源性，ERβ cDNA序列與尼羅羅非魚的有86％同源性。隨后通過半定量PCR實驗初步確定了這三種基因在雌魚肝臟、卵巢和雄魚肝臟中的相對表達量。上述實驗結(jié)果為進一步研究Vtg、ERβ、ERβ基因奠定了分子生物學的基礎(chǔ)。根據(jù)實驗獲得的的三段cDNA片段分別設(shè)計Real-time PCR引物。并對河川沙塘鱧進行腹腔注射NP(NP)和BaP(BaP)暴露實驗。

4、對注射200mg/kg NP的雄性河川沙塘鱧在第1、2、4、7、10、14天分別取樣；對注射20mg/kg BaP的雌性河川沙塘鱧也在第1、2、4、7、10、14天分別取樣。此外，用50、100、200mg/kg的NP對雄性河川沙塘鱧注射暴露，6天后取樣；用2、10、20mg/kg的BaP對雌性塘鱧注射暴露，6天后取樣。將上述所有樣品分別進行檢測，其中肝臟樣品用于Vtg、ERα、ERβ基因的RT real-time PCR定量實驗；血清

5、樣品則應(yīng)用ELISA實驗方法檢測Vtg蛋白的表達量。 結(jié)果顯示：在NP的時間效應(yīng)實驗中，隨著注射暴露實驗的開始，雄性河川沙塘鱧的ERα、ERβ和Vtg mRNA都有一個先升后降的過程，并且ERα、ERβmRNA上升和下降的趨勢先于Vtg。說明NP對于ERα、ERβ和Vtg mRNA都有誘導作用，且ERα、ERβ和Vtg之間可能存在調(diào)控與被調(diào)控的關(guān)系。NP的濃度效應(yīng)實驗體現(xiàn)了NP濃度越高，誘導作用越強的特點。BaP作為芳香烴受體的

6、激動劑，其時間效應(yīng)實驗結(jié)果與NP類似，但上調(diào)和下降的時間提早，20mg/kg BaP對雌性河川沙塘鱧有誘導的作用。BaP的濃度效應(yīng)實驗與時間效應(yīng)實驗對應(yīng)，低濃度和中濃度BaP對ERα、ERβ、Vtg基因以及Vtg蛋白具有抑制作用，高濃度20mg/kg時表現(xiàn)出促進作用。將上述ELISA檢測方法應(yīng)用于太湖水域環(huán)境雌激素的監(jiān)測。分別在冬季四個地點、春季六個地點進行采樣。結(jié)果顯示，河川沙塘鱧春季血清Vtg蛋白的含量要明顯高于冬季。雄性河川沙塘鱧