白腐菌多功能過氧化物酶Ca2+結合區(qū)結構功能研究.pdf

1、目的:多功能過氧化物酶(VP)是一種主要來源于側耳菌屬（Pleurotus）和煙管菌屬(Bjerkandera)的可以氧化多種底物的氧化還原酶類。所以多功能過氧化物酶有很好的應用前景，它不但可以氧化木質素和染料，還可以氧化降解多種藥物使其降解為無毒或低毒物質以減弱這些藥物對環(huán)境和人體的危害。但是由于這種酶在氧化環(huán)境、高溫環(huán)境及過酸過堿環(huán)境中極不穩(wěn)定而限制其實際應用。多功能過氧化物酶的兩個結構鈣離子對于維持酶的活性和穩(wěn)定性有很大的作用。參

2、與構成多功能過氧化物酶兩個鈣離子結合區(qū)的氨基酸對酶的性質的影響，特別是針對近端鈣離子結合區(qū)的相關研究較少。本研究擬通過對多功能過氧化物酶兩個鈣離子結合區(qū)氨基酸的定點突變來闡明其結構與穩(wěn)定性的關系
　　研究方法:在本研究中，將經密碼子優(yōu)化的多功能過氧化物酶基因克隆至pET-32a和pPICZαA表達載體中并在pET-32a載體上構建了多功能過氧化物酶兩個鈣離子結合區(qū)共9個氨基酸的定點突變體(D48A、G60S、D62A、S64A、S

3、170A、D187A、T189A、V192T和D194A)。然后將pPICZαA-VP電轉至畢赤酵母中以甲醇誘導表達并將野生型多功能過氧化物酶(pET-32a-VP)和各突變體轉化至E.coliBL21(DE3)中在IPTG的誘導及血紅素存在的條件下過表達并對其酶學相關性質進行檢測，檢測項目包括比酶活、酶反應動力學、酶反應的最適pH值、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、鈣離子含量及二級結構分析。比酶活的檢測底物包括ABTS、RB5、VA及Mn2+。

4、
　　結果:1.經雙酶切、菌落PCR及測序顯示pPICZαA-VP、pET-32a-VP及各突變體構建成功。2.盡管嘗試不同誘導表達條件，多功能過氧化物酶在畢赤酵母中的表達均未成功，SDS-PAGE分析顯示無目的蛋白條帶。3.多功能過氧化物酶及各突變體在E.coli中表達成功，經Ni柱純化后得到高純度的酶液。4.除了近端鈣離子結合區(qū)的突變體S170A、S170D和V192T外，幾乎所有的突變體都完全喪失活性。5.與野生型VP相比，

5、S170A、S170D和V192T的最適pH值都從3.0偏移至3.5。6.WT VP、S170A、S170D及V192T的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性關系與其比酶活相類似:WT VP＞V192T＞S170A＞S170D。7.鈣離子濃度檢測顯示，WT VP平均每個酶分子包含兩個鈣離子;而以S170A為代表的活性部分喪失的突變體平均每個酶分子含有1.5個鈣離子;以D48A和D187A為代表的活性幾乎完全喪失的突變體平均每個酶分子含有1.1個和0.7