酸性脲酶的制備、純化及其性質(zhì)研究.pdf

1、酸性脲酶因能夠耐受酸性環(huán)境，并且在大部分的低乙醇度酒精飲料中仍具有很高的活性，因而可以用來去除其所含有的尿素，從而降低酒精飲料中的氨基甲酸乙酯。本論文主要對(duì)來源于Enterobactetsp.R-SYB082的酸性脲酶進(jìn)行了提取、純化及性質(zhì)研究。 在細(xì)胞破碎階段主要考察了高壓勻漿法，結(jié)果表明在勻漿壓力80MPa、勻漿3次、菌體濃度1.50g/L的條件下破碎效果最佳，細(xì)胞破碎率達(dá)到了90％，酶活收率為110％。 在粗分離階

2、段應(yīng)用聚乙二醇-磷酸氫二鉀雙水相體系對(duì)細(xì)胞破碎后的粗酶液進(jìn)行萃取，結(jié)果表明在聚乙二醇分子量為4000，聚乙二醇濃度為15％，磷酸氫二鉀濃度為10％，體系pH值6.0，NaCl濃度4％時(shí)，酸性脲酶的收率達(dá)到了83％，純化倍數(shù)為4.5。 粗酶經(jīng)過Superdex200凝膠過濾層析和MonoQ離子交換層析后，回收率42％，純化倍數(shù)為9.18。SDS-PAGE電泳為單一條帶，其N端8個(gè)氨基酸殘基序列為：Ser-Phe-Lys-Met-A

3、sp-Arg-Lys-Gln。表明該條帶為同種蛋白。凝膠過濾法測(cè)定全酶分子量為430kDa左右，SDS-PAGE測(cè)定分子量為72kDa左右，表明該酶為同源六聚體。 酶反應(yīng)的最適pH值為4.5，最適溫度為35℃。酶的pH穩(wěn)定范圍為4.0-6.0，在25-55℃之間酶有較好的熱穩(wěn)定性，相對(duì)酶活都在80％以上。當(dāng)酶液在較高溫度(65℃)時(shí)，保存3h相對(duì)酶活仍在50％左右。在35℃，pH4.5時(shí)，該酶表觀Km及Vmax分別為19.5μm