成人手足口病相關(guān)腸道病毒非中和抗體反應(yīng)的初步研究.pdf

1、腸道病毒(enterovirus，EV)是自然界中普遍存在的一類病毒，至今已發(fā)現(xiàn)200多個(gè)血清型和基因型，可引發(fā)多種疾病，包括常見(jiàn)的由EV71和CA16感染引起的手足口病(hand，foot，and mouth disease，HFMD)。目前中和抗體檢測(cè)是對(duì)腸道病毒血清學(xué)檢測(cè)的有效途徑，對(duì)于以交叉表位為核心的非中和抗體反應(yīng)的研究尤其是腸道病毒的ELISA檢測(cè)方面尚未形成有價(jià)值的研究成果。
　　本研究首次應(yīng)用非中和抗體檢測(cè)的方法，

2、探究到正常人群血清中腸道病毒A種(CA5、CA10、CA6、CA16、EV71)，對(duì)照組腸道病毒B種(CB3)和C種(PV1)幾種病毒VP1的非中和抗體水平及其動(dòng)態(tài)變化，提高了對(duì)腸道病毒感染的普遍性的認(rèn)識(shí)，對(duì)建立基于ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA的腸道病毒流行病學(xué)監(jiān)測(cè)方法有重要意義。
　?。ㄒ唬┠c道病毒VP1序列的全基因合成及原核表達(dá)
　　全基因合成了PVI和HAV衣殼蛋白VP1的DNA序列，構(gòu)建pET-32a-PV1 VP1和

3、pET-32a-HAV VP1原核表達(dá)載體。另選取本實(shí)驗(yàn)室已制備好的pET-32a-EV71 VP1，pET-32a-CA16 VP1,pET-32a-CA5 VP1,pET-32a-CA6 VP1,pET-32a-CB3 VP1原核表達(dá)載體，原核表達(dá)并用鎳柱親和層析的方法純化上述七種重組蛋白;經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定，獲得了純度較高的EV71，CA16，CA5，CA6，CB3，PV1和HAV VP1的重組蛋白。

4、
　　（二）上海獻(xiàn)血員腸道病毒VP1非中和抗體反應(yīng)的檢測(cè)和分析
　　以本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的新型免疫球蛋白結(jié)合分子(Novel Evolved Immunoglobulin(Ig)-Binding Molecule，NEIBM)LD5作為二抗，應(yīng)用NEIBM-ELISA方法，分別檢測(cè)了腸道病毒A種的EV71，CA16，CA5，CA6，腸道病毒B種的CB3，腸道病毒C種的PV1及嗜肝病毒屬的HAV等七種腸道病毒VP1在2013年8

5、月和2014年5月收集的上海市正常獻(xiàn)血員血清中的非中和抗體反應(yīng)水平，并對(duì)48份高反應(yīng)血清進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)。通過(guò)對(duì)抗體反應(yīng)水平、抗體反應(yīng)相關(guān)系數(shù)、競(jìng)爭(zhēng)抑制水平和競(jìng)爭(zhēng)抑制的相關(guān)系數(shù)等指標(biāo)的綜合分析發(fā)現(xiàn)，上海正常人群血清中普遍存在腸道病毒的非中和反應(yīng)抗體;不同病毒的抗體反應(yīng)強(qiáng)度不同，抗CB3 VP1非中和抗體反應(yīng)最強(qiáng)，抗PV1 VP1次之，抗腸道病毒A種VP1反應(yīng)較弱，抗HAV VP1抗體反應(yīng)最弱;不同病毒VP1非中和抗體反應(yīng)的相關(guān)系

6、數(shù)與氨基酸序列的同源性水平成正比;EV71VP1與腸道病毒A種的其他成員的非中和抗體反應(yīng)特點(diǎn)不同;不同時(shí)間，腸道病毒的非中和抗體反應(yīng)出現(xiàn)明顯差異。
　　（三）上海獻(xiàn)血員腸道病毒VP1非中和抗體反應(yīng)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)
　　為深入探究腸道病毒的非中和抗體反應(yīng)能否用于腸道病毒流行情況的檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)應(yīng)用NEIBM-ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA兩種方法，檢測(cè)腸道病毒A種的CA10，CA6，CA16，EV71，腸道病毒B種的CB3，腸道病毒C

7、種的PV1六種腸道病毒VP1在2014年4月、2014年6月、2014年8月、2014年10月、2014年12月和2015年3月收集的上海市正常獻(xiàn)血員血清中的非中和抗體反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化。對(duì)抗體反應(yīng)水平、抗體反應(yīng)相關(guān)系數(shù)、競(jìng)爭(zhēng)抑制水平和競(jìng)爭(zhēng)抑制的相關(guān)系數(shù)等指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn):不同時(shí)間，各病毒VP1的反應(yīng)性水平無(wú)明顯變化;不同時(shí)間，抗體反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)相對(duì)平穩(wěn);不同時(shí)間，各病毒VP1競(jìng)爭(zhēng)抑制率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與上述指標(biāo)不同的是，競(jìng)爭(zhēng)抑制率相關(guān)系

8、數(shù)有很明顯的變化:CA16 VP1與EV71 VP1競(jìng)爭(zhēng)抑制抗-CA16 VP1的相關(guān)系數(shù)隨時(shí)間變化明顯，2014年4月和6月，二者相關(guān)系數(shù)小于0.1，8月-12月二者相關(guān)系數(shù)均大于0.4，提示2014年4月，正常人群中可能有CA16的流行;2014年8月，CB3 VP1與除CB3以外的其他腸道病毒VP1競(jìng)爭(zhēng)抑制抗-CB3 VP1的相關(guān)系數(shù)出現(xiàn)了一致的明顯下降，提示2014年8月，正常人群中可能有CB3的流行;2014年6月，CA10

9、VP1與除CA10以外的其他腸道病毒VP1競(jìng)爭(zhēng)抑制抗-CA10VP1的相關(guān)系數(shù)出現(xiàn)了一致的明顯下降，提示2014年6月，正常人群中可能有CA10的流行;2014年10月，PV1 VP1與除PV1以外的其他腸道病毒VP1競(jìng)爭(zhēng)抑制抗-PV1VP1的相關(guān)系數(shù)出現(xiàn)了一致的明顯下降，提示2014年10月，正常人群中可能有PV1的流行。
　　為驗(yàn)證上述對(duì)腸道病毒在正常人群中流行狀況的推測(cè)，我們又進(jìn)行了正常獻(xiàn)血員血清抗腸道病毒VP1-IgG、I

10、gM的非中和抗體檢測(cè)。分析抗體反應(yīng)水平和相關(guān)系數(shù)可知，2014年4月，抗-CA16 VP1 IgG和IgM抗體反應(yīng)水平與其他月份有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，2014年4月至8月，抗-CA16 VP1 IgG和IgM抗體反應(yīng)相關(guān)系數(shù)大于0.4，高于其他月份，支持2014年6月正常人群中有CA16的流行;2014年8月-12月，抗-CB3 IgG和IgM反應(yīng)性相關(guān)系數(shù)大于0.3，高于其他月份，支持2014年8月正常人群中有CB3的流行;2014年6月抗-