黃瓜枯萎病高效拮抗枯草芽孢桿菌的篩選及生防機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、黃瓜枯萎病是保護地黃瓜生產中的嚴重障礙,由于防治過程中化學農藥的大量使用,目前已造成了嚴重的環(huán)境污染和經濟損失,因此研制高效、安全、無污染的綠色生物農藥顯得尤為迫切??莶菅挎邨U菌是土壤和植物微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢生物種群,具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用,在生物防治領域具有巨大的應用開發(fā)潛力。篩選高效拮抗黃瓜枯萎病菌的枯草芽孢桿菌,研究菌株作用機理以及田間防治效果具有重要的理論和實踐意義。
  本文從采集的10份植物根圍土樣中,以黃瓜枯

2、萎病菌尖鐮孢菌(Fusarium oxysporum)為指示菌株,篩選出1株高效廣譜拮抗生防菌株B29。經形態(tài)學、生理生化反應及 BIOFOSUN微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
  利用單因子實驗對枯草芽孢桿菌B29菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。結果表明,該菌株的最優(yōu)培養(yǎng)基為1%全糖粉、0.6%牛肉膏和0.3%酵母膏;最適培養(yǎng)條件為溫度30℃、初始pH值7.0~7.5、裝

3、液量50mL/250mL、接種種齡15~18h、培養(yǎng)時間32h。研究了B29菌株的20L自控罐發(fā)酵和2000L發(fā)酵罐中試發(fā)酵,在穩(wěn)定的中試生產工藝下生產的枯草芽孢桿菌菌劑達每毫升35億活芽孢。
  通過室內生測試驗,求出B29菌株抑制尖鐮孢菌生長的有效中濃度EC50=9.17×105活芽孢/mL。1年2季4點田間小區(qū)試驗表明:35億/毫升枯草芽孢桿菌100×(3.5×107cfu/mL)、250×(1.4×107cfu/mL)和5

4、00×(7×106cfu/mL)稀釋菌液對黃瓜枯萎病的防效分別為70.3~88.2%、62.3~85.9%和54.7~80.6%。2年田間大區(qū)示范中,枯草芽孢桿菌B29菌劑(7×106cfu/mL)對黃瓜枯萎病防效達84.9%,增產12.57%。
  研究了35億/毫升枯草芽孢桿菌菌劑的毒理學、對環(huán)境生物的毒性和對田間幾種主要蔬菜及作物的安全性。結果枯草芽孢桿菌菌劑急性經口、經皮毒性 LD50均大于5000 mg/kg,屬于微毒類

5、;對家兔皮膚無刺激性,對家兔眼為輕度刺激性;致敏率為0,屬弱致敏物。35億/毫升枯草芽孢桿菌菌劑對鵪鶉、蜜蜂、斑馬魚、家蠶的急性毒性為低毒級。另外枯草芽孢桿菌 B29菌株對幾種主要蔬菜及作物種子的出苗和生長發(fā)育沒有不良影響。
  對枯草芽孢桿菌 B29菌株產生抗菌物質的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。結果表明,最佳培養(yǎng)條件為溫度30℃、初始pH值7.5、裝液量75mL/250mL、培養(yǎng)時間120h。利用30%~70%(NH)2SO4飽和溶液從

6、發(fā)酵液中提取獲得的抗菌粗提物對高溫具有一定的穩(wěn)定性;對蛋白酶 K具有部分耐受性,對胰蛋白酶和胃蛋白酶較敏感。經 DEAE-52纖維素吸附和Bio-Gel?P-100分子篩凝膠層析分離,成功純化獲得具有抑菌活性的單一蛋白組分 B29I;通過 SDS-PAGE、IEF-PAGE和HPLC測定該蛋白分子量為42.3kDa,等電點為5.69,純度達97.81%;通過質譜分析獲得了抗菌蛋白 B29I的肽指紋圖譜,經檢索初步確定抗菌蛋白B29I為一

7、種新蛋白,其N端序列為 GRIWHN,3個隨機肽段序列分別為KTHVLEDEFK,KGYQTGDFGAYLH和RTYEVAEESPVLGL。研究了抗菌蛋白 B29I的抑菌能力和作用機理,結果表明,抗菌蛋白 B29I抑制尖鐮孢菌和立枯絲核菌菌絲生長的IC50值分別為45μM和112μM;抗菌蛋白B29I明顯抑制尖鐮孢菌(F. oxysporum)孢子萌發(fā),并抑制芽管伸長,同時導致部分萌發(fā)的孢子變形扭曲、腫脹和破裂。
  采用利福平抗

8、性誘導和黃綠熒光蛋白基因分別對枯草芽孢桿菌B29菌株進行標記,研究該生防菌在黃瓜幼苗根際的定殖規(guī)律。結果在溫室和田間自然條件下,通過浸種、灌根或兩種處理方式相結合,枯草芽孢桿菌 B29菌株均可在黃瓜幼苗根內、莖基部和根際土壤中很好地定殖。浸種和灌根相結合的處理方式利于生防菌的定殖。該菌株較強的定殖能力使其可以充分發(fā)揮空間、營養(yǎng)競爭和抑制病菌的作用,從而表現(xiàn)較好的防治效果。
  對枯草芽孢桿菌 B29菌株誘導黃瓜根系相關防御反應酶活

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