雙氫青蒿素對喉癌干細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其相關(guān)機制研究.pdf

1、喉癌（Laryngeal cancer）是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率正在逐年上升，在東北地區(qū)喉癌能占到所有腫瘤的5.7％-7.6%。喉癌目前的治療包括手術(shù)和放化療、生物治療等多種治療手段有機的結(jié)合。但是患者的生存并沒有得到很大的改善，腫瘤的復發(fā)及轉(zhuǎn)移是患者治療失敗的主要原因。
　　近年來，腫瘤干細胞（Cancer stem cells，CSCs）理論的提出為腫瘤轉(zhuǎn)移的研究提供了新的視角，CSCs的理論認為CSCs是存在于腫

2、瘤內(nèi)的極少數(shù)細胞，充當干細胞的角色，并具有自我更新、多向分化、高致瘤及高轉(zhuǎn)移性的特性，是腫瘤的起源。目前CSCs的研究已經(jīng)有了很大的進展，在白血病以及多種實體瘤中包括喉癌中都分離出了CSCs。在本研究中，我們從CSCs的角度去分析腫瘤轉(zhuǎn)移可能的來源與機制。
　　由于CSCs對多種化療藥物耐藥，產(chǎn)生抵抗，目前許多化療藥物對喉癌的治療并不十分理想。所以尋求新的抗腫瘤藥物是非常必要的。以前的研究發(fā)現(xiàn)，廣泛用于臨床的抗瘧藥物雙氫青蒿素（D

3、ihydroartemisinin, DHA）是從青蒿素中提取的倍半萜內(nèi)酯類物質(zhì)的衍生物，可以抑制多種腫瘤包括頭頸腫瘤的生長，具有安全、高效、副作用小等優(yōu)點。但DHA對喉癌侵襲、轉(zhuǎn)移是否具有抑制作用及機制目前仍不清楚。所以，我們針對這兩大問題展開研究，通過體外和在體實驗探討介導喉癌侵襲、轉(zhuǎn)移的主要細胞及其DHA對喉癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是否有抑制作用及其可能的機制。
　　第一部分：喉癌CSCs的分離及其體外侵襲和遷移能力的研究
　　

4、目的:比較喉癌Hep-2細胞系CD133+與CD133-細胞在侵襲轉(zhuǎn)移能力方面的差別，并探討其存在差異的機制。
　　方法：
　　1.用流式細胞分選技術(shù)分離出細胞表面標記CD133+及CD133-的喉癌Hep-2細胞，分別培養(yǎng)后再檢測陽性細胞中CD133的陽性表達率。
　　2.應用Transwell小室這項技術(shù)檢測兩種細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的差異。
　　3.Westen blot檢測兩種細胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9、

5、E-cadherin的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.流式細胞分選的結(jié)果：PE標記的CD133抗體染色后，流式細胞檢測顯示喉癌Hep-2細胞表面CD133的陽性表達率為3.4±0.559%，無血清培養(yǎng)一周后再經(jīng)流式檢測CD133+純度測定為86.5±3.011%。
　　2.Transwell小室檢測結(jié)果顯示：兩種細胞在traswell小室的上室培養(yǎng)24小時后，與CD133-細胞相比，CD133+細胞顯示出更強的侵襲、遷

6、移能力（P<0.01）。
　　3.Western blot結(jié)果：侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9在CD133+細胞中的相對表達量為（0.87±0.016）明顯高于CD133-細胞（0.643±0.011），使用T檢驗的方法檢測兩組之間的蛋白相對表達量，兩者之間有顯著的統(tǒng)計學差異（t=20.08， P<0.01）。另一種侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)的蛋白E-cadherin與MMP-9相反，在CD133-細胞中的表達量明顯高于CD133+細胞，兩種細胞

7、中該蛋白的表達量分別為 CD133+（0.376±0.0200）， CD133-（0.791±0.015），T檢驗檢測兩組之間的差異有統(tǒng)計學意義（t=28.49， P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.CD133+喉癌細胞較CD133-細胞的侵襲遷移能力更強，可能是在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中的主要責任細胞。
　　2.CD133+細胞的高侵襲性可能與CD133+細胞自身表達更多的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9以及丟失粘附蛋白E-ca

8、herin有關(guān)。
　　第二部分：DHA通過抑制STAT3信號途徑干擾喉癌CSCs的侵襲和遷移作用的研究
　　目的：觀察DHA抑制喉癌干細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用，并探討其作為潛在的STAT3抑制劑對STAT3所激活的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路的阻斷作用。
　　方法：
　　1.將流式分選出的CD133+細胞根據(jù)培養(yǎng)條件的不同分為4組：（1）無血清培養(yǎng)，不添加任何藥物及激活或干擾因子（對照組）；（2）在（1）的基礎(chǔ)之上加入細胞因子

9、IL-6（20ng/ml）；（3）先加入IL-6作用1h，然后再加入DHA；（4）在（1）的基礎(chǔ)上只加入藥物DHA。同理，用另外一個條件低氧進行干預也分為4組：（1）單純的無血清常氧培養(yǎng)；（2）無血清低氧培養(yǎng)；（3）低氧培養(yǎng)的同時加入DHA；（4）無血清常氧培養(yǎng)再加入DHA。
　　2.用Transwell小室技術(shù)檢測上述不同培養(yǎng)條件下CD133+細胞的侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量的變化。
　　3.Western blot檢測上述不同條件（I

10、L-6和低氧）激活STAT3，以及再加入DHA后， HIF-1α（乏氧條件下），STAT3，p-STAT3以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9、E-cadherin的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.Transwell結(jié)果：
　　(1)在IL-6和/或DHA外加因素作用后，喉癌干細胞轉(zhuǎn)移的結(jié)果顯示：未處理組即對照組（162±13）個/HP，IL-6組（310±13）個/HP，IL-6+DHA組（57±9）個/HP，DHA組（4

11、8±6）個/HP。應用單因素方差分析檢測四組之間的差異有統(tǒng)計學意義（F=1184， P<0.01），應用Tukey’s multiple comparison test方法比較組內(nèi)兩兩的差別，IL-6組和對照組相比（q=41.92， P<0.01）,IL-6組和IL-6+DHA聯(lián)合組比較（q=71.28，P<0.01）,對照組和DHA組相比較（q=32.06，P<0.01）。四組喉癌干細胞侵襲的結(jié)果：對照組（107±3）個/HP，IL-

12、6組（204±7）個/HP，IL-6+DHA組（44±7）個/HP， DHA組（30±7）個/HP方差分析四組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(F=1453, P<0.01)，IL-6組和對照組相比（q=46.68，P<0.01）,IL-6組和IL-6+DHA聯(lián)合組比較（q=76.79，P<0.01）,對照組和DHA組相比較（q=37.11， P<0.01）。
　　(2)在低氧和/或DHA作用后，各組喉癌干細胞經(jīng)Traswell轉(zhuǎn)移的結(jié)果

13、示：常氧組（137±9）個/HP，低氧組（229±7）個/HP，低氧+DHA組（59±4）個/HP，常氧+DHA組（39±5）個/HP。四組之間單因素方差分析結(jié)果顯示四組之間的差異有統(tǒng)計學意義（F=1675，P<0.01），各組之間的比較如下：常氧組和低氧組（q=43.68，P<0.01），低氧組和低氧+DHA組（q=80.57，P<0.01），常氧組和常氧+DHA組（q=46.32，P<0.01）。四組細胞Transwell侵襲的結(jié)果

14、示：常氧組（122±10）個/HP，低氧組（190±7）個/HP，低氧+DHA（58±6）個/HP，常氧+DHA（39±7）個/HP，四組之間比較經(jīng)統(tǒng)計學分析四組之間的差異有統(tǒng)計學意義(F=705.9，P<0.01)，常氧組和低氧組（q=26.35，P<0.01）,低氧組和低氧+DHA組（q=51.35， P<0.01），常氧組和常氧+DHA組（q=32.19，P<0.01）。
　　2.Western blot結(jié)果：
　　(

15、1)在IL-6和/或DHA作用于喉癌干細胞后，Western blot檢測相關(guān)蛋白p-STAT3，STAT3，以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9，E-cadherin在四組中的表達量的變化，使用單因素方差分析對結(jié)果統(tǒng)計。STAT3在四組中的表達量無明顯差別，無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。p-STAT3在四組中表達量的差異有統(tǒng)計學意義(F=10190,P<0.01)，組內(nèi)兩兩之間進行比較，IL-6作用后較對照組的表達量增加（q=20.87，P

16、<0.01）,加入DHA后，IL-6+DHA組較IL-6組的蛋白量又明顯減少（q=183.5，P<0.01），與照組相比該蛋白在DHA組的表達量也明顯下降（q=165，P<0.01）。MMP-9的表達趨勢變化與p-STAT3相似，四組之間的差異同樣有統(tǒng)計學意義（F=7830，P<0.01）,四組之間進行比較，在IL-6組表達最多，與對照組相比有統(tǒng)計學意義（q=51.5，P<0.01），而IL-6+DHA組與IL-6組相比，MMP-9的表

17、達量明顯下降（q=143.7， P<0.01）,單獨加DHA與對照組相比也明顯下降了（q=232.9，P<0.01）。E-cadherin的變化趨勢則與上述兩種蛋白相反，四組之間的差異仍有統(tǒng)計學意義（F=1219, P<0.01），IL-6作用后表達量反而降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（q=9.845，P<0.01）。該蛋白在IL-6+DHA組較IL-6組的表達水平明顯升高，差異明顯，有統(tǒng)計學意義（q=59.85，P<0.01）。D

18、HA單獨組和對照組比較,E-cadherin的表達水平升高差異也有統(tǒng)計學意義（q=59.53，P<0.01）。
　　(2)喉癌干細胞低氧和/或DHA作用后，Western blot檢測相關(guān)蛋白乏氧因子-1α（HIF-1α），p-STAT3和STAT3以及侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9和E-cadherin的表達量變化。用單因素方差分析對結(jié)果進行統(tǒng)計、評定。HIF-1α在四組中的表達的差異同樣有統(tǒng)計學意義（F=350.9，P<0.01

19、）。低氧培養(yǎng)后， HIF-1α的表達量明顯升高，與對照組相比有統(tǒng)計學意義（q=28.32，P<0.01）。加入DHA后其表達量顯著下降，低氧+DHA組比低氧組明顯減少（q=8.26，P<0.01），且DHA組和對照組比較表達量也顯著降低（q=12.80，P<0.01）。p-STAT3和MMP-9的表達趨勢與HIF-1α相似，四組之間的差異也有統(tǒng)計學意義（F=2187，P<0.01, p-STAT3;F=4833， P<0.01，MMP-

20、9），在低氧培養(yǎng)后均升高，表達量與相應的對照組比較均有統(tǒng)計學意義，p-STAT3（q=34.68，P<0.01），MMP-9（q=45.31，P<0.01）。同樣，在加入DHA后，與相應的對照組比較，這兩種蛋白的表達量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義，常氧組和常氧+DHA組相比p-STAT3（q=63.68， P<0.01），低氧和低氧+DHA組相比p-STAT3（q=90.30，P<0.01）,常氧組和常氧+DHA組相比MMP-9（q=11

21、5.7，P<0.01）,低氧組和低氧+DHA組比較MMP-9（q=99.39，P<0.01）。STAT3在四組的表達水平無明顯差異（P>0.05）。E-cadherin在四組中的差異也有統(tǒng)計學意義（F=17730， P<0.01）。低氧條件下較常氧時表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（q=8.848， P<0.01）。而加入DHA后其相應的對照組E-cadherin的表達水平呈現(xiàn)升高的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義，常氧組和常氧+DHA組比較（q=25

22、8.7， P<0.01），低氧組和低氧+DHA組比較（q=196.1，P<0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.IL-6和低氧的作用可以提高喉癌干細胞的侵襲、遷移能力。
　　2.DHA可以抑制喉癌干細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機制可能與DHA特異性的抑制p-STAT3的激活，從而使得其下游的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達受到影響。
　　第三部分：人喉癌Hep-2細胞系的CD133-和CD133+細胞在體內(nèi)侵襲和轉(zhuǎn)移能力的對比研究

23、r>　　目的：比較CD133-和CD133+細胞在體內(nèi)的侵襲、轉(zhuǎn)移的差異，并檢測侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達，分析可能的機制。
　　方法：
　　1.將裸鼠隨機分為2組，分別通過尾靜脈注射CD133-和CD133+細胞建立轉(zhuǎn)移模型。觀察小鼠的一般情況，并記錄小鼠生存時間。
　　2.對各組肺組織HE染色，觀察并計數(shù)各組肺組織所形成的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。
　　3.Western blot檢測兩組肺轉(zhuǎn)移灶中侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達情

24、況，分析可能的機制。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠的一般情況：我們所建立的小鼠的侵襲、轉(zhuǎn)移模型對小鼠的一般情況影響較大，尾靜脈注射腫瘤細胞后隨著時間延長肺轉(zhuǎn)移灶逐漸形成的過程中，一部分小鼠的體重出現(xiàn)了相應的變化，在生長期出現(xiàn)了體重下降。CD133-細胞組的小鼠在第31天有2只開始出現(xiàn)體重下降，第33天有3只開始出現(xiàn)體重下降。CD133+細胞組的小鼠在第19天有3只，第21天有2只，29天有1只小鼠開始出現(xiàn)體重逐漸下降。在體重下降

25、后，小鼠的活動、精神狀態(tài)等也逐漸開始減低。但兩組體重之間的差異無統(tǒng)計學意義。
　　2. CD133-和CD133+細胞分別建立的轉(zhuǎn)移模型中肺轉(zhuǎn)移的情況的比較：CD133-細胞組肺組織轉(zhuǎn)移程度較輕，肉眼觀察肺組織紅潤，表面光滑，而CD133+細胞組的肺組織表面可見明顯轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成，肺組織略顯蒼白。經(jīng)HE染色后，鏡下觀察兩組肺組織，與CD133-細胞組相比，CD133+細胞組肺轉(zhuǎn)移灶明顯較大，且數(shù)量多。經(jīng)T檢驗兩組肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目有統(tǒng)計學

26、差異（t=2.615，P<0.05）。
　　3.比較CD133-和CD133+細胞在體內(nèi)所建立的肺轉(zhuǎn)移模型對小鼠生存的影響：CD133-細胞組小鼠在尾靜脈注射細胞后第34天、36天分別有1只小鼠出現(xiàn)毫無征兆的死亡，生存率分別為85.71%和71.43%。在第39天有3只小鼠突然出現(xiàn)死亡，最終生存率為28.57%。按照執(zhí)行安樂死及實際死亡小鼠進行計算，CD133+細胞組在第29天，31天和34天分別有1只小鼠死亡，生存率分別下降為8

27、5.71%，71.43%和57.14%。第39天有3只小鼠死亡，最終生存率為28.57%。應用Kaplan-Meier法對數(shù)據(jù)進行整理分析，Log-rank test方法對兩組生存情況進行比較，得出P>0.05,兩組之間生存的差異沒有統(tǒng)計學意義。
　　4.CD133-和CD133+細胞組轉(zhuǎn)移瘤在侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達的比較：實驗結(jié)束后，Western blot檢測轉(zhuǎn)移瘤中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果：p-STAT3在兩組中的表達有

28、明顯的差別，CD133+細胞組的相對表達量為1.70±0.05，明顯高于CD133-細胞組（0.83±0.30），經(jīng)T檢驗，兩組之間的差異有統(tǒng)計學意義（t=4.879，P<0.01）。而STAT3在兩組之間的表達量無明顯差異。侵襲相關(guān)蛋白MMP-9在兩組轉(zhuǎn)移瘤中的相對表達量也有明顯的差異， CD133+細胞組為1.74±0.51，明顯高于CD133-細胞組（0.47±0.15），兩組的差異有統(tǒng)計學意義（t=4.168, P<0.05）。

29、另一種轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白E-cadherin在兩組之間的相對表達水平則與MMP-9相反，CD133+細胞組為0.86±0.14，明顯低于CD133-細胞組，兩組之間的差異有統(tǒng)計學意義（t=4.241，P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.與CD133-細胞相比，CD133+細胞更易在體內(nèi)發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，我們推測CD133+細胞可能是介導腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的主要細胞。
　　2.CSCs中STAT3的組成性激活可以導致下游侵襲、轉(zhuǎn)移

30、相關(guān)蛋白MMP-9的表達增高，E-cadherin的表達降低，使細胞獲得更強的侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。
　　第四部分：DHA對喉癌CSCs侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其機制的在體實驗研究
　　目的：檢測DHA對腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的抑制作用，并通過檢測侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達的變化，探究可能的機制。
　　方法：
　　1.將14只BALb/c雄性裸鼠均經(jīng)尾靜脈注射CD133+細胞建立體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型。將裸鼠隨機分為2組，對照組和實驗組。實驗組

31、給予DHA（100mg/Kg），對照組給予DMSO。觀察并記錄小鼠的一般情況以及小鼠的生存時間。
　　2.對兩組小鼠的肺組織進行HE染色，觀察并計數(shù)兩組所形成的肺轉(zhuǎn)移灶。
　　3.應用Western blot檢測兩組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶中侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達情況，并分析DHA對小鼠體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移影響的可能機制。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠的一般情況：對照組的小鼠分別在第9天、17天、25天，分別有1只小鼠開始出現(xiàn)體重下降

32、，另2只均在第53天開始出現(xiàn)體重下降，其中1只在第59天體重下降了25%。另外1只小鼠雖然體重下降未達到原體重的20%，但出現(xiàn)反應遲鈍、跛行、退縮等反應。實驗組有1只小鼠在第23天突然出現(xiàn)體重下降，精神欠佳等。兩組之間體重的差異無統(tǒng)計學意義。
　　2.DHA可以抑制肺部轉(zhuǎn)移灶的形成：實驗結(jié)束后，對比觀察兩組的肺組織，對照組肺組織顏色蒼白，表面有大量的轉(zhuǎn)移灶，而實驗組肺組織顏色紅潤，肺表面轉(zhuǎn)移灶明顯少于對照組。對肺組織進行HE染色，

33、并對兩組肺部所形成的轉(zhuǎn)移灶分別進行計數(shù)和統(tǒng)計學分析，得出兩組差異有統(tǒng)計學意義（t=2.940，P<0.05）。
　　3.應用DHA后對小鼠生存的影響：對照組在第12天、24天、29天分別出現(xiàn)1只小鼠死亡，生存率分別下降為85.71%，71.43%，57.14%。第59天有2只小鼠死亡，最終生存率為28.57%。而實驗組僅在第29天出現(xiàn)1只小鼠死亡，其余小鼠精神狀態(tài)及飲食情況未見明顯變化，均存活至少59+天，總生存率為85.71%。

34、Kaplan-Meier法對兩組的生存情況進行整理分析，并用Log-rank test方法對兩組的生存進行比較，得出實驗組的生存率明顯高于對照組（P<0.05）。
　　4.DHA的應用對腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的影響：我們通過Western blot方法分析兩組肺轉(zhuǎn)移灶侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達情況。P-STAT3在實驗組的相對表達量（0.235±0.059）明顯低于對照組（1.063±0.222）。經(jīng)T檢驗，兩組的表達水平差異明顯（

35、t=6.248，P<0.01）。STAT3在兩組中的表達量無明顯差異。侵襲相關(guān)蛋白MMP-9在實驗組的表達水平為0.300±0.033，明顯低于對照組（0.926±0.289）。兩組之間的差異有統(tǒng)計學意義（t=3.731，P<0.01）。而轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白E-cadherin在加入DHA后的表達水平為（1.305±0.319），顯著高于對照組（0.737±0.138）。
　　結(jié)論：
　　1.DHA可以顯著抑制腫瘤在體內(nèi)的侵襲、轉(zhuǎn)