SIRT1通過(guò)線粒體自噬阻斷NLRP3炎癥小體活化和足細(xì)胞損傷.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 NLRP3炎癥小體在醛固酮誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中的作用
　　目的:探討NLRP3炎癥小體活化在Aldo誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中的作用。
　　方法:免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)慢性腎臟病(MCD、FSGS)患兒腎組織中NLRP3的表達(dá)。體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞系MPC5，應(yīng)用不同濃度的Aldo(25、50、100、200 nM)刺激不同的時(shí)間(2、4、8、12、24、48 h)。體外應(yīng)用NLRP3

2、siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞24h，加Aldo刺激，分為四組:陰性對(duì)照組(negative control，NC)、NC+Aldo組、NLRP3 siRNA組、NLRP3 siRNA+Aldo組。體外應(yīng)用MnTBAP、CsA預(yù)處理足細(xì)胞30min，再加用Aldo刺激，分組如下:對(duì)照組、CsA組、Aldo組、CsA+Aldo組、MnTBAP組、MnTBAP+Aldo組。應(yīng)用real-time PCR、westernblot及ELISA檢測(cè)足細(xì)胞N

3、LRP3炎癥小體活化后相關(guān)指標(biāo)(NLRP3、IL-18及caspase-1)的表達(dá)。應(yīng)用caspase-3、-8、-9試劑盒檢測(cè)三者的活性。體內(nèi)研究中，通過(guò)腹腔埋置滲透性微泵構(gòu)建Aldo腎損傷模型，分別于第1、3、5、7、14天處死小鼠;對(duì)NLRP3基因敲除(NLRP3-/-)小鼠亦通過(guò)腹腔埋置Aldo滲透性微泵模型，分為四組:野生型對(duì)照組、野生型加Aldo組、NLRP3-/-對(duì)照組、NLRP3-/-加Aldo組，于第14天處死小鼠，檢

4、測(cè)尿蛋白、肌酐、PAS染色后光鏡下腎組織病理學(xué)改變、電鏡下足細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，免疫熒光檢測(cè)腎組織中NLRP3的表達(dá)，應(yīng)用real-time PCR及western blot檢測(cè)足細(xì)胞損傷指標(biāo)nephrin和podocin。
　　結(jié)果:(1)免疫組化結(jié)果及NLRP3表達(dá)量的積分光密度統(tǒng)計(jì)值(IOD)顯示MCD和FSGS患者腎組織中NLRP3的表達(dá)明顯增高。原發(fā)性腎病綜合征患者尿液中IL-18表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高。(2) Real-t

5、ime PCR、western blot及ELISA結(jié)果顯示Aldo呈劑量依賴(lài)性地誘導(dǎo)足細(xì)胞NLRP3和IL-18的表達(dá)及分泌，Aldo50nM刺激24h時(shí)NLRP3和IL-18表達(dá)開(kāi)始增加，200nM時(shí)達(dá)到高峰;Aldo亦呈時(shí)間依賴(lài)性地誘導(dǎo)NLRP3和IL-18的生成，Aldo100nM時(shí)刺激4h時(shí)IL-18的分泌即增加，且一直持續(xù)至24h。(3) Aldo灌注小鼠腎損傷模型結(jié)果顯示，Aldo灌注后第3天NLRP3表達(dá)開(kāi)始增加（主要表

6、達(dá)在腎小球足細(xì)胞），第5天進(jìn)一步升高并持續(xù)到14天，caspase-1在第7天時(shí)上升且14天時(shí)最為明顯，IL-18于第5天表達(dá)增加且持續(xù)到14天。Aldo灌注第5天nephrin表達(dá)開(kāi)始下降（降低37％）且持續(xù)到第14天。(4) NLRP3 siRNA阻斷足細(xì)胞NLRP3炎癥小體的活化，并抑制Aldo誘導(dǎo)的caspase-1及IL-18表達(dá)，以及足細(xì)胞凋亡和nephrin表達(dá)下降;此外，NLRP3 siRNA亦阻斷了Aldo誘導(dǎo)的cas

7、pase-3、-8、-9活化。(5) NLRP3基因敲除可顯著抑制Aldo誘導(dǎo)的小鼠腎組織NLRP3炎癥小體活化，抑制腎小球體積增大和系膜增生，并降低蛋白尿。電鏡下Aldo灌注的野生型小鼠出現(xiàn)廣泛的足突融合，而NLRP3基因敲除小鼠幾乎保持著正常的足細(xì)胞形態(tài)。NLRP3基因敲除阻斷了Aldo對(duì)nephrin和podocin表達(dá)的抑制作用。(6)CsA可通過(guò)阻斷mPTP孔的開(kāi)放，進(jìn)而減輕Aldo引起的線粒體功能障礙，恢復(fù)線粒體膜電位及mt

8、DNA拷貝數(shù)。CsA同時(shí)抑制NLRP3炎癥小體的活化，降低NLRP3表達(dá)及炎癥因子IL-18釋放減少。與CsA作用相似，MnTBAP亦阻斷了NLRP3炎癥小體的活化。
　　結(jié)論:Aldo通過(guò)誘導(dǎo)線粒體功能障礙，進(jìn)而活化NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷。
　　第二部分 SIRT1對(duì)NLRP3炎癥小體活化和炎癥因子表達(dá)的影響
　　目的:探討SIRT1對(duì)NLRP3炎癥小體活化和炎癥因子表達(dá)的影響。
　　方法:應(yīng)用免疫組

9、化檢測(cè)慢性腎臟病(MN、MCD、FSGS)患兒腎組織中SIRT1的表達(dá)。體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞系MPC5，應(yīng)用SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞。分為三組:空白對(duì)照組(control，con)、空載對(duì)照組(vehicle，vehi)、SIRT1 siRNA組。應(yīng)用SIRT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染足細(xì)胞24h，加用Aldo刺激，分為四組:Vehi組、SIRT1過(guò)表達(dá)組、Vehi+Aldo組、SIRT1過(guò)表達(dá)+Aldo組。采用熒光探針2，7-二氯二氫熒光素乙酰

10、乙酸(2，7-dichlorofluorescein diacetate，DCHFDA)染料檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平;JC-1染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位;real-time PCR檢測(cè)mtDNA拷貝數(shù);AnnexinⅣ-PI雙染及流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞凋亡情況;westernblot檢測(cè)足細(xì)胞nephrin、NLRP3的表達(dá);應(yīng)用caspase-3、-8、-9試劑盒分別檢測(cè)三者的活性。應(yīng)用ELISA檢測(cè)炎癥因子IL-18的表達(dá)。體內(nèi)研

11、究中，應(yīng)用NPHS2-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與SIRT1flox/flox轉(zhuǎn)基因小鼠交配，制備足細(xì)胞條件性SIRT1基因敲除小鼠，即SIRT1flox/flox NPHS2cre(+)，對(duì)照組小鼠為SIRT1flox/flox NPHS2cre(-)。對(duì)SIRT1 flox/flox NPHS2cre(+)小鼠腹腔埋置Aldo滲透性微泵，分為四組:SIRT1 flox/floxNPHS2cre(-)對(duì)照組、SIRT1 flox/flox NP

12、HS2cre(-）+Aldo組、SIRT1 flox/flox NPHS2cre(+）對(duì)照組、SIRT1flox/flox NPHS2cre(+)+Aldo組。于第14天處死小鼠，檢測(cè)尿蛋白、肌酐、PAS染色觀察腎組織病理學(xué)改變、電鏡足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，免疫熒光檢測(cè)腎組織中NLRP3及WT1的表達(dá)，real-time PCR和western blot檢測(cè)足細(xì)胞標(biāo)志nephrin和podocin以及NLRP3活化指標(biāo)NLRP3、caspa

13、se-1及IL-18的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)免疫組化結(jié)果顯示SIRT1在正常腎組織中高表達(dá)，在MN、MCD患兒腎組織中明顯降低，而在FSGS患者中幾乎不表達(dá)。(2)應(yīng)用siRNA敲低SIRT1后，足細(xì)胞出現(xiàn)明顯的線粒體功能障礙，ROS產(chǎn)生增加，線粒體膜電位以及mtDNA拷貝數(shù)顯著下降。同時(shí)，足細(xì)胞凋亡明顯增多，caspase-3、caspase-9活性增加以及nephrin表達(dá)降低。敲低SIRT1亦顯著促進(jìn)NLRP3表達(dá)及IL-

14、18的分泌。
　　結(jié)論:SIRT1可以阻斷Aldo誘導(dǎo)的線粒體功能障礙，抑制NLRP3炎癥小體活化，減輕足細(xì)胞損傷。
　　第三部分 BNIP3介導(dǎo)的線粒體自噬在SIRT1阻斷NLRP3炎癥小體活化中的作用
　　目的:探討B(tài)NIP3介導(dǎo)的線粒體自噬在SIRT1阻斷NLRP3炎癥小體活化中的作用。
　　方法:應(yīng)用上述制備的足細(xì)胞條件性SIRT1基因敲除小鼠制備Aldo灌注模型，real-time PCR及wester

15、n blot檢測(cè)線粒體自噬相關(guān)基因(BNIP3、Beclin-1、Atg5及LC3)的表達(dá)。體外培養(yǎng)的足細(xì)胞轉(zhuǎn)染BNIP3質(zhì)粒24h后應(yīng)用Aldo刺激，實(shí)驗(yàn)分為四組:Vehi組、BNIP3過(guò)表達(dá)組、Vehi+Aldo組、BNIP3過(guò)表達(dá)+Aldo組。采用TUNEL檢測(cè)足細(xì)胞凋亡，real-time PCR及western blot檢測(cè)nephrin、podocin及NLRP3的表達(dá)，熒光探針MitoSOX檢測(cè)線粒體內(nèi)ROS水平，real

16、-time PCR檢測(cè)mtDNA拷貝數(shù)，JC-1染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位。
　　結(jié)果:(1)野生型小鼠Aldo灌注后BNIP3、Beclin-1和Atg5表達(dá)增加，而足細(xì)胞條件性SIRT1基因敲除小鼠抑制了BNIP3、Beclin-1和Atg5的表達(dá)，提示足細(xì)胞條件性敲除SIRT1基因抑制線粒體自噬。(2)BNIP3過(guò)表達(dá)后可阻斷Aldo誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，抑制nephrin、podocin表達(dá)下降。另外，BNIP3過(guò)表達(dá)