含N芳雜環(huán)類HIV-1非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑及埃博拉病毒侵入抑制劑的研究.pdf

1、艾滋病，又稱為“獲得性免疫缺陷綜合征”(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，是一種廣為人知的嚴(yán)重威脅著人類生命健康的傳染性疾病。自1981年被首次報道以來，已造成3500多萬人的死亡。最新的權(quán)威數(shù)據(jù)顯示，近年來艾滋病在全球范圍內(nèi)仍屬高發(fā)態(tài)勢，其防控形勢依然嚴(yán)峻。
　　人類免疫缺陷病毒HIV(Human immunodeficiency virus)是造成人類艾滋病感染的罪魁禍?zhǔn)住Ｋ?/p>

2、感染破壞人體免疫系統(tǒng)功能，繼而并發(fā)機會性感染和惡性腫瘤，最終導(dǎo)致感染者死亡。HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，具有兩個亞型，其中，HIV-1是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致艾滋病感染的主要類型。
　　HIV-1病毒的復(fù)制周期非常復(fù)雜，主要包括吸附、融合、逆轉(zhuǎn)錄、整合、轉(zhuǎn)錄、翻譯、裝配、出芽和釋放等一系列過程。這些環(huán)節(jié)也為我們對HIV病毒的復(fù)制進(jìn)行藥物干擾提供了機會。其中，逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse transcriptase，RT)由于在病毒生命周期中極為重要

3、的作用，成為一個非常成熟的抗HIV藥物作用靶點。針對逆轉(zhuǎn)錄酶的非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs)因其高活低毒、選擇性強等優(yōu)點，在臨床治療中廣泛應(yīng)用。
　　二芳基嘧啶類(DAPYs)化合物是NNRTIs的經(jīng)典代表，已經(jīng)有兩個化合物依曲韋林(ETR)和利匹韋林(RPV)作為新一代藥物上市。但相繼出現(xiàn)的耐藥病毒株、藥代動力學(xué)性質(zhì)不佳以及毒

4、副作用等問題嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。因此，研發(fā)對靶點結(jié)合作用更強、理化性質(zhì)更優(yōu)的新型的HIV-1NNRTIs，以提高其抗耐藥性和藥代性質(zhì)，依然是目前抗艾滋病藥物領(lǐng)域的研究熱點。
　　目前此類化合物與逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解析，闡明了的DAPY類化合物與RT的結(jié)合模式。研究顯示，代表性配體分子ETR在結(jié)合口袋中呈現(xiàn)“U”型構(gòu)象，通過四個區(qū)域（與兩個芳香環(huán)形成π-π堆積和疏水作用的A區(qū)、與嘧啶環(huán)形成氫鍵作用的B區(qū)、開放型凹槽狀的蛋

5、白-溶劑界面作用區(qū)（C區(qū)），以及第四個可拓展的NNRTI進(jìn)入通道區(qū)域（D區(qū)））與逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生重要的相互作用或潛在的結(jié)合力。并且此類結(jié)構(gòu)中的三個芳環(huán)基團(tuán)通過之間的雜原子來進(jìn)行旋轉(zhuǎn)或平移，從而靈活地調(diào)整自身構(gòu)象以適應(yīng)結(jié)合口袋，并且增強了分子的抗耐藥性。在對此充分理解的基礎(chǔ)上，我們結(jié)合一類具有優(yōu)秀抗耐藥性和藥代性質(zhì)的新型吡咯并嘧啶類DAPY類似物RDEA640的結(jié)構(gòu)特征，在上市藥物依曲韋林的結(jié)構(gòu)上嘗試對其母環(huán)進(jìn)行優(yōu)化，期望加強分子與RT中D區(qū)

6、的相互作用，并對兩翼苯環(huán)取代基進(jìn)行多樣化地衍生。由此，在第二章第二節(jié)中，我們設(shè)計并合成了一類含有橋頭N原子的5，7-二取代吡唑并[1，5-a]嘧啶類化合物（系列A，共18個化合物），希望發(fā)現(xiàn)耐藥性和藥代性質(zhì)更好的新型NNRTI。細(xì)胞水平的抗HIV病毒活性篩選顯示，大部分化合物具有亞微摩爾或微摩爾水平的野生型HIV-1病毒抑制活性。其中活性最高的化合物A5a其半數(shù)抑制濃度達(dá)到了70納摩爾，遠(yuǎn)高于第一代同類上市藥物，選擇性指數(shù)為3999。但

7、所有化合物沒有顯示出對K103N/Y181C雙突變株的抑制活性?？笻IV逆轉(zhuǎn)錄酶活性實驗證實了此類化合物的作用靶點。我們還通過計算機模擬手段分析了其理化性質(zhì)和作用模式，為后續(xù)結(jié)構(gòu)優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。
　　在第二章第三節(jié)中，我們結(jié)合最新的生物結(jié)構(gòu)信息，在本課題組大量先期工作的基礎(chǔ)上，優(yōu)選了其中3個最好的中心芳環(huán)結(jié)構(gòu)，并新增兩個在藥化中廣泛應(yīng)用的優(yōu)勢片段，共五種含N芳香雜環(huán)作為新設(shè)計化合物的中心母環(huán)。另外，由于上市藥物RPV的氰基乙烯基在

8、與RT結(jié)合中的特殊作用模式，我們選取了它作為新化合物左翼苯環(huán)對位取代基。通過整合各種優(yōu)勢基團(tuán)，希望發(fā)現(xiàn)各項性質(zhì)更好的化合物，由此我們設(shè)計了系列B NNRTIs，共21個化合物。細(xì)胞水平活性測試顯示，15個化合物對野生型HIV-1病毒株顯示出了200nM以下的EC50值，更有9個化合物顯示出了個位數(shù)納摩爾水平的半數(shù)抑制能力。其中，化合物B10a活性最高，其EC50值達(dá)到1.5納摩爾，選擇性指數(shù)達(dá)到90730，超過陽性對照藥物ETR。隨后，

9、我們對活性較高的化合物進(jìn)行了對多種常見耐藥毒株抑制能力的測試，多個化合物顯示出良好的抗耐藥性。其中，B4c對重要的耐藥株K103N和E138K的EC50值分別達(dá)到1.8和6.8納摩爾，高于所有采用的陽性對照藥物;對L100I和Y181C的EC50均為10納摩爾，與ETR和AZT相當(dāng)?；衔顱17a，對野生株和突變株均顯示出極其優(yōu)秀的活性，分別是1.7nM(WT)、11nM(L100I)、1.6nM(K103N)、2.8nM(E138K)

10、、29nM(Y181C)、160nM(Y188L)和84nM(F227L+V106A)。并且由于B17a毒性更低，它顯示出了比ETR更好的選擇性。小鼠肝微粒體穩(wěn)定性研究顯示，B17a的半衰期為60.8分鐘，遠(yuǎn)超上市藥物RPV，與ETR相似，具有廣闊的開發(fā)前景，更多的成藥性評價正在積極開展之中。
　　埃博拉出血熱，是一種由埃博拉病毒引起的，多發(fā)于靈長類動物的人畜共患傳染病，其病死率高達(dá)50％到90％。在最近的2014到2016年，西

11、部非洲爆發(fā)了有史以來的一次最嚴(yán)重和復(fù)雜的埃博拉疫情，引起了全世界范圍的極大恐慌和關(guān)注。雖然已有幾種候選疫苗進(jìn)入了臨床試驗階段，多個藥物也正處于研究或開發(fā)階段，但是目前并沒有一種特效的埃博拉出血熱治療措施或者藥物得到美國FDA的批準(zhǔn)，臨床上主要采取對癥治療策略。因此，探究埃博拉病毒的傳播機制，并且開發(fā)出具有針對性的、有效性的治療方法有著極其重大的科研與社會意義，也是抗病毒藥物研究領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。
　　哈佛醫(yī)學(xué)院Cunningham教

12、授（合作導(dǎo)師）實驗室通過高通量篩選及結(jié)構(gòu)修飾發(fā)現(xiàn)了作用于埃博拉病毒侵入人體必需的宿主蛋白NPC1的金剛烷二肽哌嗪類化合物3.47。它具有納摩爾水平的對埃博拉病毒的體外抑制活性，但較差的藥代動力學(xué)性質(zhì)限制了它作為候選藥物的繼續(xù)開發(fā)。
　　針對化合物3.47的結(jié)構(gòu)特征和代謝過快的問題，在第三章第二節(jié)中，我們系統(tǒng)性、針對性地對其結(jié)構(gòu)中右翼芐基（C1系列）、中間二肽鏈（C2系列）和左翼金剛烷（C3系列）的易代謝位點進(jìn)行了替換和封閉等修飾。

13、共設(shè)計合成了三個系列，24個化合物。通過細(xì)胞水平的活性測試和小鼠肝微粒體代謝穩(wěn)定性測試等實驗，盡管最終沒有發(fā)現(xiàn)保持一定活性并具有更佳藥代動力學(xué)性質(zhì)的化合物，但極大地拓展了此類化合物的構(gòu)效關(guān)系信息。
　　大量藥物開發(fā)研究顯示，分子的理化性質(zhì)與其藥代動力學(xué)行為密切相關(guān)。由此總結(jié)出的藥物化學(xué)著名規(guī)律中，Lipinski五規(guī)則以及Gleeson4/400規(guī)則都是基于分子量、logP等理化性質(zhì)的關(guān)于化合物成藥性的重要統(tǒng)計規(guī)律。它們顯示，具有

14、較好藥代動力學(xué)性質(zhì)的化合物其分子量基本在400左右，脂水分配系數(shù)在2-3的范圍內(nèi)。除此之外，還有一些具有指導(dǎo)性的概念和參數(shù)，例如配體效率(Ligand efficiency，LE)、親脂性配體效率(lipophilic ligand efficiency，LLE)和更加綜合性的LELP指數(shù)。通過它們可以有效地評價分子中分子大小和親脂性對活性貢獻(xiàn)的效率，從而指導(dǎo)藥物化學(xué)工作，更好地把握化合物藥代性質(zhì)和生物活性的平衡。
　　基于前期工

15、作的基礎(chǔ)和上述藥物開發(fā)規(guī)律，我們在第三章第三節(jié)中，通過骨架躍遷、生物電子等排等多種藥物化學(xué)策略，對化合物3.47結(jié)構(gòu)的兩翼進(jìn)行了多輪簡化，以降低其分子量和親脂性，并最終改善其藥代動力學(xué)性質(zhì)。在此過程中，我們設(shè)計合成了6個系列（C4-C9系列），共86個化合物，發(fā)現(xiàn)了多個簡化的優(yōu)勢基團(tuán)，并通過這些優(yōu)勢基團(tuán)的聯(lián)合，發(fā)現(xiàn)了多個抗埃博拉病毒侵入抑制活性既得到保持、代謝穩(wěn)定性也得到增加的化合物，如C7a和C7f。其后氘代藥物策略的引入及手性化合物

16、的拆分，使我們得到了活性和穩(wěn)定性進(jìn)一步提升的化合物C8p、C9g和C9n。更加全面的體外藥代動力學(xué)評價證明它們的水溶性(＞75μM)、肝微粒體代謝穩(wěn)定性（鼠，T1/2=2.0-11min;人，T1/2=6.7-32.4min）、血漿穩(wěn)定性（在4h以上穩(wěn)定）、血漿蛋白結(jié)合率(86.0-94.0％)等性質(zhì)均比先導(dǎo)化合物3.47有很大提升（水溶性5.3μM，小鼠肝微粒體代謝穩(wěn)定性T1/2=1.0min，mPPB高）。同時，口服方式下的小鼠體內(nèi)