佩梅樣病GJC2基因突變對Cx47蛋白亞細胞定位影響的研究.pdf

1、佩梅樣病(Pelizaeus-Merzbacher-like disease， PMLD， OMIM608804）是一種嬰幼兒期起病的常染色體隱性遺傳白質腦病，其發(fā)病率國內外尚無統(tǒng)計報道，男女發(fā)病率無明顯差異。2004年，Uhlenberg等人將其致病基因定位于1q41-42的縫隙連接蛋白 C2(gap junction protein gamma-2， GJC2， GenBank NM-020435)，又稱GJA12(gap junc

2、tion protein alpha12， GenBank AAB94511)，編碼縫隙連接蛋白47（gap junction protein connexin47, Cx47），Cx47蛋白表達于少突膠質細胞，與星形膠質細胞表達的Cx43蛋白形成Cx47/Cx43異型耦聯(lián)通道。少突膠質細胞和星形膠質細胞通過此通道來維持細胞之間的信號傳遞及細胞間和細胞內的離子平衡，對于中樞神經系統(tǒng)的髓鞘形成和維護具有重要作用。目前PMLD的致病機制尚不

3、明確，既往研究發(fā)現(xiàn)，不同突變體的致病機制不同，并提出了三方面機制：⑴突變的GJC2不能形成Cx47；⑵突變的GJC2形成的Cx47在內質網大量聚集，不能被運送至細胞膜，影響與Cx43形成耦聯(lián)；⑶異常的Cx47與Cx43能形成耦聯(lián)但功能異常。
　　目的:
　　本研究是為了揭示從中國 PMLD患者中發(fā)現(xiàn)的5種GJC2突變對Cx47蛋白亞細胞定位改變的影響：GJC2突變后導致其編碼的Cx47聚集于內質網，影響其正常的膜上轉運，無法

4、與Cx43形成正常耦聯(lián)通道，破壞了少突膠質細胞的功能，導致少突膠質細胞凋亡，從而揭示該5種GJC2突變類型的致病機制。同時，為PMLD未來的治療提供理論依據和實驗基礎。
　　方法:
　　在pEGFP-N1-GJC2野生型質粒的基礎上，通過定點突變的方法，構建在PMLD患者中檢出的5種未報道的GJC2突變的突變體質粒：GJC2 c.201C>G（p.C67W）、c.216delGinsAA（p.P73fsX106）、c.217

5、C>T（p.P73S）、c.735C>A（p.C245X）、c.973G>C（p.A325P）。用Lipofectamine2000試劑盒脂質體介導的化學方法轉染人類少突膠質細胞系MO3.13，建立GJC2的突變型和野生型模型，并用ER-tracker將細胞內質網標記為紅色熒光，用DAPI將細胞核標記為藍色熒光，應用激光共聚焦顯微鏡技術觀察野生型Cx47蛋白和突變型Cx47蛋白的亞細胞定位。
　　結果:
　　成功構建了5種突

6、變型pEGFP-N1-GJC2質粒；通過激光共聚焦顯微鏡技術觀察發(fā)現(xiàn)，野生型Cx47蛋白大部分分布在少突膠質細胞的細胞膜上，僅少部分貯積于內質網中，約5.2％；而突變型Cx47蛋白卻大部分貯積在內質網中，不同Cx47突變體在內質網中的貯積程度不同，C67W、P73fsX106、P73S、C245X、A325P的貯積率分別為91.4%、81.4%、87.1%、88.3%、89.7%。
　　結論:
　　5種GJC2突變均為致病性